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▼今実験でうまくいかないこと▼パート5▼

1 :(`・ω・´):2005/07/12(火) 00:53:17
いま実験でうまくいかないことスレッドです。
グチからアドバイスまで幅広く語り合いましょう。

★過去スレ★

いま実験でうまくいかないことスレッド
http://cheese.2ch.net/life/kako/967/967541407.html
▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1009340905/
▼今実験でうまくいかないこと▼パート3▼
http://science2.2ch.net/life/kako/1026/10263/1026312578.html
▼今実験でうまくいかないこと▼パート4▼
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1093050850/

☆主な関連スレ☆

◆生物学専門家への質問はここに書き込めPart15◆
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1116773294/
◆2ch高校生のための生物質問板 3時間目◆
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1115527096/
質問に対して小学生でも分かる説明をレスするスレ
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1108460479/
タンパク質の精製3
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1104733094/

2 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/12(火) 01:13:42
>>970=1
激しく乙!!
アンタ男気あんな。ホレたよ (*´Д`*)

3 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/12(火) 01:15:08
スマソ
sageちゃったのでもういっちょパピコ
>>1 乙!!(もういっちょう言っておこう

4 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/17(日) 01:50:59
前スレが議論の途中で1000レスになっちゃったね。
パート5があったんだ。
アゲます。

5 :960:2005/07/17(日) 18:41:34
だから
いやん
つったのに

早漏気味に立てたから
重複スレが勃っちゃったぢゃないか
ヽ(`Д´)ノ


6 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/17(日) 23:26:52
こっちが本スレですよage

7 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/18(月) 05:21:21
で,,,
だな

前スレで
フェノクロはきちんと遠心しろということだったけど
本当?

その昔
ハイパービンボーラボにいたときのこと
フェノクロはチビタン10分でやっていたが
大丈夫だったよ
ちなみにrfcは15000*gの1分20秒分

8 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/18(月) 13:41:31
なぁ、エチブロ染色したゲルってどう廃棄すればいいか教えてもらえませんか?
今までは普通の燃えるゴミで出してたんですけど…
なんか他の研究室では集めてどうにかしてるとか聞いちゃって不安で不安で

9 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/18(月) 14:24:19
>>8
そのまま廃棄は日本では禁止。
ちゃんと濾過処理してください。

10 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/18(月) 14:35:25
ゲルをろ過するんかい。

11 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/18(月) 14:55:39
>>9 脳内禁止かよ

12 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/18(月) 16:58:47
>>9
ゲルをゲルろ過するんかいw
詳細よろ。

>>7
別にフェノが水層から取り除ければ問題はない。
残ると非常に困るからきっちりと遠心するのが万国共通だと思うぞ。
別にビンボーラボだからといって遠心時間を長くしても大して変化は
ないと思うけどな。電気代も払えないんだっつうんなら別だが、そこまで
して実験すんなとは言いたくなる。事故のもとだ。

13 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/18(月) 17:40:52
>>10,12
そちらはどう処理してます?

14 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/18(月) 22:40:51
萌えるゴミとして捨てる

15 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/18(月) 22:43:24
俺の場合、助手の先生に萌えているわけだがwww
もうね、大事にしてもらってますwww

16 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/19(火) 20:32:20
エチブロはハイターと混ぜて排水溝へデカント

17 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/19(火) 20:53:02
色気のある後輩に気を取られて悩んでいます.

18 :10:2005/07/19(火) 20:58:41
>>13
可燃ゴミとして捨ててる。
ゲルでしょ?バッファーじゃなくて。

>>16
ハイター禁止
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1118469739/l50

19 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/19(火) 21:59:51
ハイターは毒性がupするらしいね。
きっちりフィルターかけましょう。

20 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/19(火) 22:36:18
>>8
普通の燃えるごみってのは本当に普通の燃える一般ごみか?
実験用可燃ごみじゃなくてか?
つぅか一般用に出してタンならアンタの研究室停止喰らうぞ。

21 :ミツケタヨ!!カス発見!!:2005/07/19(火) 22:59:06
>20
>つぅか一般用に出してタンならアンタの研究室停止喰らうぞ。
世間知らずな奴がいるよ、プッ
どんな文書にも、「エチブロ」を一般ゴミで捨ててはいけない
なんて書いていないんだけど。
チミは妄想の中では、どういう法律が制定されているんだい?
チミの妄想レベルはグリーンピースと同レベルだナw

くれぐれも、奴らみたいに暴力には走るなヨw
いきなり射殺されたら、こまっちゃうw



22 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/19(火) 23:33:12
>>21
エチブロは、日本じゃそのまま捨ててはいけなかったはず。
そのまま捨ててもお咎め無しなのは、アメリカとかのラボじゃないの?

23 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/19(火) 23:33:39
>>11でも既に脳内禁止と・・・

24 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/19(火) 23:34:21
>>22 ここにも脳内禁止が・・・

25 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/19(火) 23:58:35
で、リアルではどうなんだよ!

26 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/20(水) 00:17:50
>>25
いや、リアルでダメなはず。

27 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/20(水) 04:21:17
リアルでは
規制はない
はず

劇物及び毒物取締法の別表にはリストアップされていない
水質汚濁防止法にかかる政令には排出基準は示されていない
土壌汚染対策法にかかる有害物質ではない



28 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/20(水) 09:32:18
以降エチブロの話はこのスレで禁止ね。 エチブロって実験か?

29 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/20(水) 09:34:28
サイトトラップ上手くいってるラボある?

30 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/20(水) 13:08:05
人生が上手くいきません

どうしたらよかですか?

31 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/20(水) 13:18:52
人生って実験か? 以降人生の話禁止ね。

32 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/20(水) 16:04:15
すまんが、少し聞いて欲しい。
レトロウイルスの作成するのに、すごいことにGag/polプラスミド
く手に入れたい。ウイルスベクターとエンベロープはあるんだが、
gag/pol はどうやったら手に入りますか?
宝があるみたいだが、自分で増やすのはちよっと、、、。といわれてしまった。(だめとは言われなかった)。
使ってみてもいいのかな。切実です。

33 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/20(水) 19:58:36
>>31

万物の創造主の壮大で気まぐれな大規模網羅的ハイスループット実験です>人生色々



34 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/20(水) 20:35:59
>>27
排水溝に直でてんぷら油を捨てるくらい良くない。
明文化して規制はされてないけど、常識としてはダメって言うレベル。

他に言い直せば、道で煙草吸って、ポイ捨てするくらいいけない行為。

35 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/20(水) 22:20:34
テトラサイクリンとかカナマイシンを
入れた大腸菌などの培地、オートクレーブした後どうしている?
下水とかに流すと、耐性菌を増やす原因になるから、環境に放出は
だめ、といわれたが・・・・

36 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/20(水) 22:22:45
いくら抗生物質でもオートクレーブやブリーチ処理したら大丈夫やね。

37 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/20(水) 22:37:11
>耐性菌を増やす原因になる
これ本当?

38 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/20(水) 23:12:12
P1系の大腸菌なら、多分下水で条件が良ければ生きていけるかも知んないけど、
薬剤耐性形質はプラスミドで持ってるから、耐性発現不要の場合はプラスミドが無くなっちまうよ。
だから、無問題。

でも、確りオートクレーブに掛けて殺すのが原則。
守らんと、停止処分。

39 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/21(木) 00:04:56
そうじゃなくって、
菌は死んでも耐性遺伝子は残るということでしょ。
それがナチュラルコンピテンスで取り込まれて、
まかり間違って広まったらどうするの?って話。
可能性はあるけど、それを言ったら何もできなくなる。
オートクレーブ後の菌使って、
PCRかけたらどうなるんだろね。
増えちゃったりして^^;

40 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/21(木) 00:09:24
今どきアンピシリンでもないだろうがな。

41 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/21(木) 00:20:46
>>39
いや、取り込めない・

42 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/21(木) 17:03:34
つーか、自然にある DNaseで分解されちまうだろ。

43 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/21(木) 17:11:21
でもウンチや肥料中の微生物フロラや元になった食材や植物材料を推定
するためPCRやれるぢゃん。

DNAはけっこう強いよ。

44 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/21(木) 17:54:10
PCRはかかるかもしれないけど、直鎖になってるから、機能しないんでは?
と考えるがどうだろう。

45 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/23(土) 01:26:10
下水とかにいる菌が耐性持つのが問題になってたら、
もっと対策とってるだろ。

だから大丈夫。といってみる・・・

46 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/23(土) 01:44:55
DNA/RNAの混合水溶液を加熱処理してRNAを選択的に壊したいのですが、
文献で加熱時間と分解されるRNA量を記載しているものがあれば、御紹介
頂けませんか?

47 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/23(土) 01:52:29
RNAseじゃだめなん?

48 :46:2005/07/23(土) 04:28:47
RNase使わずに済む方が良いので……
(フェノクロせんで済むし、最低限のサンプルをPCRチューブに
 入れてサーマルサイクラに乗せるだけで済むから……)

49 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/23(土) 10:47:23
素直にRNAse使うのがベスト。

50 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/23(土) 15:58:11
PEG沈は?

51 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/23(土) 22:10:23
>>48
PCRすんならRNase使えば?

ほんで、もしかしてフェノクロ('A`)マンドクセとか考えて質問してるなら、
ここでこの質問は終わりね。

52 :46:2005/07/23(土) 23:17:35
>>51
フェノクロは別にマンドクサくないですけどね。
むしろ、酵素反応が(99%は分解してくれると信じることが出来ても)
100%だと信じられないので他の手段を、と考えているのですが。

53 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/23(土) 23:19:12
>>52
RNaseは100%逃げられない。

54 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/23(土) 23:50:58
いんや
tRNAとかきつい2次構造のは
結構残ることがある


55 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/24(日) 00:48:48
RNAってアルカリで分解しなかったっけ

56 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/24(日) 00:54:50
するよ。

57 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/24(日) 01:24:44
タンパクのイオン交換クロマトを初めてやってるんすけど、
カラムから出てきません。カラムの中でアグってるのでしょうか?


58 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/24(日) 01:37:11
塩濃度をきっちり上げましょう。
大体2Mまでグラジエントかければ大丈夫だと思う。
あとカラムから出てこないって言ってるけど、なんでカラムの中に
たんぱく質が残っているのか分かったの?
タンパクがすでに流出している可能性だってあるんじゃない?

59 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/25(月) 03:58:57
カラムに捕まっていないんじゃないか?
バッファーpHを下げたり 上げたり サンプル塩濃度を下げるのも重要かと

60 : ◆177URcVeGE :2005/07/25(月) 05:22:04


61 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/26(火) 02:20:13
アガロースゲルから核酸を抽出するカラムみたいに、
アクリルアミドのゲルから核酸(RNA)を抽出できる
カラムってありませんか?
ギルバートバッファーでオーバーナイトするの面倒くさい。

62 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/26(火) 04:05:55
すみません,教えてください
1個の大腸菌内のプラスミドをさらに大量に増幅させる薬品ってなかったでしょうか?
名前をど忘れしてしまいました.

63 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/26(火) 09:27:19
クロラムフェニコールでアンプリフィケーションかけることか?
あれはpBRなんかには有効だけど、高コピーのpUCやpBluescriptにやっても
あんまり効果ないよ。

64 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/26(火) 20:01:39
>>61
切り取り→キッチリすり潰し→TE50度(忘れたがそれくらい)/1h→遠心→TE/rt/30〜1h→
遠心→kitもしくはcolumnで精製
でいけるハズ。
温度とか時間はかなり適当に今日は書いてるけど今度ノートみたらまた書き込むよ。
オボエテタラナー('A`)

65 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/26(火) 20:27:07
素直に培養ってのが一番早いんじゃ・・・

66 :46:2005/07/27(水) 01:44:55
>>61
Roche Applied Science のNAPIマニュアルか、
QIAGENのWWWサイトに何かあるかもよ。

67 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/27(水) 01:58:18
RNAseのコンタミを疑ってるんですが、RNAseがコンタミした場合、RNAサンプルの濃度を測定するとどうなるのですか?
さきほど測定したら1000ng/μl程度だったのですが、これはRNAは壊れていないと判断しても良いのでしょうか?

68 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/27(水) 02:01:33
リアルタイムPCRなんですが、今まで特異的産物しかできなかったプライマーだったのに、突然プライマーダイマーのみ生じるようになりました。水やプライマーを作り変えても効果は見られず…。どなたか原因がわかれば教えていただけませんか?

69 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/27(水) 02:47:41
>>67
RNaseを壊すってのはどうやってます?
というかRNA調整するさいにRNase入らないように気をつけましょう。

>>68
リアルタイムでどうやってプライマーダイマーだと分かったんですか?
ゲル流して確認したんだったら、RNA調整の段階を疑うか、温度を上げて見るとか・・・
あと、遮光してなかったんだったら、チミンダイマーできてそれが悪さしたとか。
いずれにしろ新しいプライマー買うのが良いかもしれませんね。

70 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/27(水) 08:54:49
>>67
経験上なので確かではないけど、同一の方法で精製した壊れてない
RNAの吸光度と比較すると、260/280の値が若干上がる。

だけど普通は電気泳動だろうなぁ。

71 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/27(水) 10:15:09
リン酸カルシウム法って、room 15minとかあるけど、1−2minでいいって診たことあるがどうなんでしょう?


72 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/27(水) 21:52:11
>>69
RNaseを完全不活性化する条件においたら、他の物質もおじゃんになるワナ?

73 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/27(水) 22:15:07
>>71
細胞へのトラフォでその短時間処理は聞いたことないが・・・・
いまはリポフェクトアミンとかが主流のような希ガス

74 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/27(水) 22:18:19
そこで天草ですよ。

75 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/27(水) 22:25:54
>>73
>>71はDNAとリン酸カルシウムの共沈殿形成のためのインキュベーション時間のことでしょ。

76 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/27(水) 22:46:06
どっちにせよ1minとかは早すぎだと思うのだが・・・

効率悪くなって困るんならキッチリ時間かけてやったほうが良くネ?

77 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/27(水) 23:05:54
>>73
それ、高いから・・・

(´・ω・) と、細胞が専門外の俺が言ってみる。

そういや、リン酸Caやリポ以外に、エテクトロがあったよね。

---

1minは流石に短いと思われ。
全く無理って事は無いだろうけど、焦って失敗したほうが時間がかかる希ガス

78 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/27(水) 23:44:33
>>77
細胞に遺伝子導入しないと結果でないような研究室はどこでも
今ではリポフェクトアミン使ってると思うぞ。
高いが効率良いし結果も良い。
お試しあれ

79 :61:2005/07/28(木) 00:18:16
>>66
ありがd。
キアゲンにはアクリルアミドゲルからのDNA抽出キットがあって、
RNAにも使えるかどうかメール出しました。
「よく分かりません」という返事でした。
ロシュについても見てみます。

80 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/28(木) 07:42:05
>>71でつ。今、原書を確認しました。
羊土社の必ずうまくいく遺伝子導入うんたらかんたらでつ。
P84のレトロウイルスの項、メモ部分。リン酸Caのページではないです。

81 :高校生:2005/07/31(日) 15:50:01
今高校で実験してるのですがイモリの再生実験は何ヶ月ぐらいかかるんでしょうか?
あとどんなことをしたら実のある実験になるでしょうか?
発表まであと一ヶ月と13日ありますがその間でどうにかなるものでしょうか?
お願いします困ってるんです教えてください

82 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/31(日) 23:06:44
>>81
真面目な話、切断箇所を色々変えたサンプルを複数用意し、
実験は並行で行う事を勧める。また、同じ条件も複数並行で進められると吉。

あと、何か化学物質による何ちゃらとかも同時並行でやると、吉。

83 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/01(月) 10:31:39
くだらん質問だが、教えて欲しい。293T細胞でレトロウイルス作る時、
中には、最初LTRも、gag-polも、envも無い。という事は、増殖能の高さを
利用しているだけなのでしょうか?もっと増殖能が高い細胞で、transfectionしやすい
細胞があればOKってことですか?


84 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/01(月) 13:38:04
>>83
増殖能力というよりも、
めちゃめちゃtransfectionしやすい細胞だから使っている
んだと思う。
ただなぜそうなのかはわからん。
誰か知っている人はいるかな?



85 :高校生:2005/08/01(月) 19:14:42
ありがとうございます
わかりました

86 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/12(金) 00:08:12
電気泳動→トランスファーで、
トランスファー後のメンブレンにいつも一番上のマーカー
(200kDa付近の)が全く写りません。

セミドライトランスファーの時間を30分から35分、40分と
長くしても全く変化ないですし、逆に下のマーカーが
オーバートランスファーになってしまうくらいです。

一般に高分子は転写されにくいという事ですが、
自分だけ特に見えないように思えます。
他の人と同じようにやってるつもりなのに。

原因がわかる方、よろしければ教えてもらえませんでしょうか。

87 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/12(金) 08:07:19
>>86
今どんな条件でやってるのかしらんけど
バッファーのSDSの量を変えてみるとか、ゲルの濃度薄くするとかやってみたら?
あとトランスファーの時間を30分から40分ってあんま意味なさそう。
どうせだったら熱に注意しながら60minとか90minとか思い切って変えてみるべき。


88 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/12(金) 14:50:24
>>86
そりゃ、均一には行かんぜよ。
高分子側がよく移るようにすれば、低分子側はもう逝っちゃってるね。
特に自分のだけ、ってことは無いぞよ。


89 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/13(土) 20:35:27
「博士を取るか?、潰れてくたばるか?ここが正念場だっ!」と毎日狂ったように実験に打ち込んでいた時期が私にもありました(AA




90 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/13(土) 22:30:30
>>86
200kDaをセミドライで効率よく転写するのは大変だと思うよ。。
>>87の条件を検討しても上手くいかなかったら、
いっそ、セミドライを諦めてウエット式にしてみるのも手かもね。
あと、CAPS bufferの系も試してみても面白いかも。


91 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/15(月) 07:20:12
セミドライ式とタンク式とどう違いますか?
おれはタンク式が好きだけど、好きな理由は特に無い。

92 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/16(火) 12:11:01
>>91
長所:セミドライの方がバッファー少なくて済む。低分子量だと転写が速い。
短所:>>90の言うように高分子量は移りにくい。といってもp300を転写させたこともあるけど。

>>86
3MMペーパーは何枚重ねてる?長時間転写してるとフィルターにしみ込んだバッファー組成も変化してくるから、少し多めに重ねた方がいいかも。

93 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/16(火) 19:21:42
温度上昇するとトリスの緩衝能が低下したりしてまずくないですか?>セミドライ

94 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/16(火) 19:29:22
アブラセミドライ
クマセミドライ
ニイニイセミドライ
ヒグラシドライ
ツクツクオーシドライ
アサヒスーパードライ

95 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/16(火) 22:16:30
ハンマーヘッドシャーク・ドライ

96 ::2005/08/16(火) 22:21:49
SELDIって何?MALDIの田中幸一さんノーベル賞と違うの?

97 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/16(火) 22:31:21
実験
(>_<)先輩の24分の一の速さですっ
もっと速く器用になりたいでつ

助教授の先生は、僕の48倍のスピードで仕事をこなします
(T_T)
速く成りたいでつ

98 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/16(火) 22:33:56
MALDI:Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization
SELDI:Similar Electron of Laser Desorption/Ionizatin
つまり電子類似体を飛ばしてその分子を決める技法。
Nopel Awardくらいは取れるんじゃね?

99 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/16(火) 22:34:42
>>97
つまりお前は実験していないって事だろ?w

100 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/16(火) 22:50:06
>>94
さりげに、この板の住人には分からなそうなドライ法が二つ混じってるなw
ということで「オジサンドライ」も加えてやってくれ。

101 ::2005/08/16(火) 23:06:20
電子類じたいを飛ばしてる?本当ですか?どの論文に、雑誌に載ってますか?

102 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/16(火) 23:07:59
>>97
お前がアホみたいに遅いのでなければ
その先輩とか助教授の先生は人間じゃねえ。
3倍とかならともかく24倍とかってなんだ。
きっと背中にチャックがついてて、中には超精密機械とか入ってるんだ、うんうん。

103 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/16(火) 23:17:01
>>102
アホみたいに遅くない実験でも、
助教授の先生は成果を出すのが6倍です。

なんといっても、やり方が、違うんです。

何の実験かは秘密ですが、
あくまで仮にの話しですが、僕はただのピペット万だけど
先生は、エッペンドルフの8連のピペット万を使うから
などの理由からです。


104 ::2005/08/16(火) 23:44:15
お前らやっぱあほの集まりだな?もっと勉強しろ、腐れども

105 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/17(水) 01:36:07
>>103
ならお前も8連使えよw

106 :萌え田萌え夫:2005/08/17(水) 01:45:55
トランスファーネタがあったので便乗させてくれ。将来の教授候補様ども。

サザンで、〜100kb亭緒までのDNAをHybond-N+にトランスファーしようと
してるんだが、メンブランにトランスファーされる時とされない時がある。
こういう経験ってない? あったなら体験談と改善法キボス。

こっちのコンディションは、0.5xTBEゲルでPFGE(パルスフィールド泳動)
で分離したDNAを、塩酸処理(0.25M HCl)30min、変性処理(1.5N NaOH、
0.5M NaCl)30min、ブロッティングはスタンダードの下から上へ、
0.4N NaOHで12時間程度。重しはシグマの無駄に分厚いカタログを乗っけてる。
翌日見ると、バッファーはカタログまで到達するほど、キムタオルは濡れ濡れ。
んで、ぺったんこになったゲルをEtBr染色するとDNAがゲルに残ってる時と
残ってない時がある。

改善してくれた殿方、奥方には漏れなくAknowledgementに掲載予定。よろ☆

107 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/17(水) 03:15:52
サザンか ( -o-)y-..oO○
なつかすぃ

バッファの濃度とか忘れたけど
アルカリブロッティングではなかったな(20xSSC)
あと
台に砥石みたいな多孔質の石を使ってた

パルスフィールドじゃなかったけど
ノンカットの高分子ゲノムDNAもほぼ転写されてた

108 :107:2005/08/17(水) 03:20:07
   ∧,,∧
  (  ・ω・)
  _| ⊃/(___
/ └-(____/
‾‾‾‾‾‾‾

  <⌒/ヽ-、___
/<_/____/  


109 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/17(水) 15:36:42
>>105仮にの話しですすめると、改良された方法だとミスるんだよな(汗

8連は使えるよw


まあ、下手なんだよorz
(ToT)

110 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/18(木) 00:03:52
>>109
何がどうやったら下手に扱えるのか分からないんだが

まぁアレだ。
取り扱い説明書を一日二回くらい読めば上手くなるんじゃね?

111 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/22(月) 23:00:44
>>106 それは重石が重すぎるに3万クレディール。
トランスファーはアガロースが薄くなってからはほとんど進まない。
ペーパータオルがふらつかない程度の重さがあればオケ。

112 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/24(水) 14:07:33
アガロースゲルからのキットを使ったDNAの回収がうまくいきません。

キアゲンのカラムのキットとビーズに吸着させるQIAX、
それからバイオジーンのキットを使って、
1-10kbのバンドを何度も拾ったけど、回収率は十分の一以下だった。

キットの溶液にゲルが溶けているのもちゃんと確認したし、
電気泳動せずに同じキットを使って精製すると
5割から7割回収できることを確認しているので、
キットの操作の問題ではない。

原因がさっぱりわからず困っています。

113 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/24(水) 14:54:26
先輩に一回やってもらったら?

114 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/24(水) 15:37:03
ゲル回収の収率ってそんなもんさ.
吸光度で測定できることのほうがマレ.

115 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/24(水) 16:22:12
>>112
吸着させるときのpHと溶出させるときのpHは大事だよ。
その辺気をつけてマニュアル読み返してみなされ。
あと長めのDNAは付きやすく剥がれにくいので、
65Cで溶出させると回収が若干よくなる。

でも7-80%で回収したいなら透析チューブに入れて電気泳動で出すのが一番。
めんどくさいけど素人でも効率よく回収できる。

116 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/24(水) 17:10:16
> 電気泳動せずに同じキットを使って精製すると
> 5割から7割回収できることを確認しているので、

回収率悪くない?それはさておき

2種類のキットで独立に回収してるのに10分の1以下というのは
操作方法が悪いか、根本的に勘違いしてるのではないだろうか。


117 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/24(水) 18:32:06
>>116
だからそれはpHがズレてるんだよ。
「電気泳動しない時は回収悪くない」のだから、
後はゲルから持ち込みのバッファーしかない。

キアゲンのQIAEXのマニュアルには「溶液の色が黄色でない時は NaOAc(pH5.3)でpHを合わせろ」
と書いてある筈。

118 :112:2005/08/24(水) 19:04:38
皆さん有難うございます。

>>113
例のごとく、分子生物学を立ち上げたばかりのラボなので、近くに詳しい人がいないのです。

>>114
そんなもんなんですか???!!!

>>115 >>117
pHは確認しています。
pHがずれてると溶液が紫に変わるのですよね。
ちゃんと黄色のままです。念のためにKOAcなんかを入れてもだめでした。

>>116
普通は8割とか9割くらいなんでしょうか?
何か根本的な勘違い・・・ちょっと考えて見ます。

119 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/24(水) 20:06:44
>>112
濃縮しようとしてエタチンとかすると、ゲルかすに絡み付いてTEに
溶けなくなっている、とか。

120 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/24(水) 20:07:20
ゲルから切り出すとダメだってことに再現性があるなら、
そのステップをいちいちチェックしてみたら?
UVのかけ過ぎって可能性もあるんじゃない?

121 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/24(水) 20:44:49
>>118
じゃあ透析チューブにゲル入れて電気泳動で出す方法にしたら?
何かがおかしいけど、>>112の情報からでは判断できない。

122 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/24(水) 21:12:18
まあ皆さんが必死なところ悪いんですが。

本気で2chでアドバイスをもらおうとしている時点で終わりですよね。w

123 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/24(水) 21:36:20
>>122
高校生・大学生ならともかく、これが院生やラボで働いてる人なら、
正直この道は諦めた方がいい気がする。

最近は、偏差値の高い国立出でも使えん奴多いしね。
偏差値のあんまり高くない理系私立のほうが数十倍良い仕事したり、良い発見したりする奴が多い。

驕り高ぶってラボ内で質問したりせず、ネットでヘルプ発してる時点で俺は終わりと思ってるが。

124 :112:2005/08/24(水) 21:39:22
またまた有難うございます。感謝です。
>>119
キットなのでエタチンは全く行ってないです。
ゲルはバッファーで完全に溶かして何度も洗浄してますので、
残っている可能性は低いです。

>>120
泳動は0.6〜1.5%アガロースをMupidで流しています。
ゲルはGTGアガロース、染色と切り出しはMupid Blueで行っています。
以前にエチブロで染めた時も、クリスタルバイオレットで染めた時も
同じような結果でした。ゲルから漏れてるのかなあ。

>>121
時間があれば透析チューブは今度試してみようと思います。
かなり技術と手間と時間が必要だと聞いていますが、どうなんでしょう?

>>122
終わっているどころか、まだ始まってもいませんよ。

125 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/24(水) 22:55:13
ゲルの容量の見積もりが甘くて、NaI濃度が足りないとか?
多めに入れてコストを別にすれば悪いことはないから、そうしたら?

126 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/24(水) 23:08:14
卒研生、院生がキットを使う等、軟弱だ。
DNA断片の切り出し精製などアガロース切片をパラフィルムで挟んで潰して染み出た液をフェノール/クロロフォルム抽出すればよろし。
mini,prep.もRNA抽出も全て自作試薬でするもんだ。

127 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/24(水) 23:27:33
アガロースやポリアクリルアミド以外で、DNA断片がすぐ回収できるような
電気泳動用ゲルはないの?

128 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/25(木) 00:52:06
まさか制限酵素で切った時にそれぞれのバンドのDNA量を計算せずに
全体の重さで計算してないだろうね。

129 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/25(木) 08:50:10
プライマーがもっといろんな種類がほしいです。

私は植物系なんですけど、参考までに皆さんが使っているプライマーについて教えていただけませんか?

アクチン、ユビキチンなんかの基本的なもので結構ですので。

130 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/25(木) 11:27:14
ゲル回収キットの溶解液は案外DNAとくっついてくるよ
溶出後 フェノクロ エタ沈すべし
エタ沈だけだとへんなもやもやが出てくる

131 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/25(木) 14:56:53
>>130
まあ回収後何に使うかによるけどね。
ライゲーションくらいだったら別にする必要ない。

132 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/25(木) 17:57:10
説明の上手な>>112の言う事を解釈すると
恐らくゲルが多すぎ.キットにもよるけど
ゲルの持ち込み量が多すぎると回収率が
著しく下がる.東洋紡のマグネット使う奴は
あんまりゲルの量は関係なかった.
キアゲンは結構センシティブ.
プロメガはその中間くらい.
エッペンドルフはプロメガと同じくらい.
って感じだったけどお前らはどうよ?

133 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/25(木) 22:40:14
>112
QIAEX2は日常的に使ってます。
自験例では、取扱説明書に準じた操作を行って0.3〜7kbの範囲のDNAの精製を
しましたが、Agaroseからの切り出しでは、7kb近い方のバンドの切り出しでも、
50%程度のyieldを得ています。(短い方はもっとyield良いです)
#yieldの推計はOD260値で行いました

ちなみに、ゲルは SIGMA Agarose Low EEO で、エチブロ入りの
TAEバッファに漬けて流しています。

QIAEX2なら、
 ゲルの固さに応じて黄色のバッファの量や水を合わせているのか
 ゲルが溶けきるまで温めて・ボルテックスしているのか
 黄色バッファでの「二度目の洗い」を忘れていないか
を伺いたいです。

134 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/25(木) 23:16:52
>112
鷲は電気泳動する前のDNAの純度を疑っちょる。
アルカリ-SDSでとったプラスミドはRNase処理をしても、
急高度で濃度の定量はできんぎょ。
PEG朕までするとかなりましだが。

要するに急高度を当てにせず、
電気泳動する前のDNA(ストックしてある奴)を数段階に希釈したレーンと、
ゲル抽後のDNA全量を流すレーンを作って
エチブロで染めろってこった。



135 :112:2005/08/26(金) 00:42:26
今夜もありがとうございます。

>>123
やっぱり終わってますか・・・・・orz お言葉、肝にめいじます。
ラボ内やラボ外の親しい人に分子生物学に明るい人がいないもので・・・
ラボ外のあまり親しくない自称分子生物学に明るい人に相談したところ、
「ダメなときは何してもだめだね。休暇をとれば?」との有難いお言葉をいただきました。

>>125
ゲル溶解バッファーはマニュアルより多めに入れているんですよ。

>>124
すみません。軟弱者で。「軟弱者!」ってセーラさんの台詞でしたっけ?

>>127
すぐに回収と言えば、ミリポアかどこかが1回の遠心だけでDNA回収するキットを出していると聞いたことがあります。

>>128
さすがにそれはないです。

>>129
オンラインジャーナルを読んで、方法に書いてある配列をコピー&ペーストで注文。


136 :112:2005/08/26(金) 00:55:57
続きです。

>>130-131
と言うことは、やはりキットを使わないでフェノクロ エタ沈した方が早いかもということですか?
でも私の場合、ライゲーションだけなので大丈夫かな?

>>132
ゲルの持ち込み量が多い時には、バッファー量を増やしてもダメですか?

>>133
ご指摘の点はかなり気をつけて実践しております。

>>134
今まで吸光度でやっておりました。
軟弱者なのでキットで大量抽出していますので、大丈夫だとは思いますが、
今度ご指摘のように確認してみようと思います。

今までバンドで測定したことがありませんで、そういった確認をしておりませんでした。
確かに吸光度はあてにならないかもしれませんよね。

137 :& ◆gWDU/vXM6A :2005/08/26(金) 07:57:20
ゲルってすぐ敗れたり台形になったりするんですが
皆さん何を気をつけていますか?

138 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/26(金) 11:49:35
>キットなのでエタチンは全く行ってないです。
>ゲルはバッファーで完全に溶かして何度も洗浄してますので、
>残っている可能性は低いです。

DNAもきれいさっぱり洗い流してそう。


>泳動は0.6〜1.5%アガロースをMupidで流しています。
>ゲルはGTGアガロース、染色と切り出しはMupid Blueで行っています。

もしかしてTBE使ってない?NaI融解時あたためてる?

>時間があれば透析チューブは今度試してみようと思います。
>かなり技術と手間と時間が必要だと聞いていますが、どうなんでしょう?

そうでもないよ。


素人はキット使えば手軽で簡単確実だと思いがちだけどさあ、
理屈わからないでキット使うとドツボにはまるって言う好例だよね。
自前の試薬でやってみ。難しくもなんともないし、効率もいいから。
ただし、リクツをちゃんと理解してないとおなじことだが。

139 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/26(金) 12:13:10
これでgatewayが普及したらどんな馬鹿な質問が来るのだろうか、、、、、

140 :& ◆TTLQTUMllo :2005/08/26(金) 13:03:16
ゲルのFixって何?

141 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/26(金) 13:34:43
>>136
ビーズで取るのはもう止めたら?
透析チューブを切ってオートクレーブして水で洗えばもう使えるから。
で、中にゲルスライスいれて、適当なバッファーで満たして、両端をクリップで止めて、
泳動槽で15分流して、UVでゲルからDNAが出てるのを確認したら、溶液をエッペンに移して、
フェノクロして、エタ沈で回収率80%〜90%はいく。

ビーズで条件検討したり2chに書き込んでる回答待ってる間にできるよ。

142 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/26(金) 13:44:08
>>112
迷わずシープラークGTGを使った方が楽だよ。
温度だけで解けるし、そもそも回収しなくてもゲル中で酵素反応できるし。

143 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/26(金) 15:09:53
>>142
それも素人向きだな。
精製するにはフェノクロ何回もやらなきゃならんが、
確実になにがしかの量は回収できる。

144 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/26(金) 15:14:55
普通のアガロースゲルでDNAを流してゲル切片をパラフィルムで挟んで押しつぶして
フェノールクロロフォルム抽出しる。これが一番簡単だ。

145 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/26(金) 15:33:30
2DGEのでかいアクリルアミドゲルを作るとゲルの上に
柔らかくて粘着な層ができてしまうのだが
これは要するに重合が不完全なわけ?

146 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/26(金) 15:37:07
質問です。どうしてフェノクロ抽出がいるの?

147 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/26(金) 16:31:11
DNA抽出・・・

スピンカラム式で問題ないはずだが?ゲル抽出なしでリカバリ5割は低い。ロスってる。
PCR産物のように大量のDNAが得られるのであればミリポアのUltrafreeDA。
遠心10分でクローニングに必要な量は十分に得られる。

キット使ってうまくできませんとかいうやつは大抵添付プロトコルを読んでいないか、
読んでいても実験手順のところだけ。トラブルシューティングすらできない。
特に放置プレイ得意なラボの場合、原因がもっと根本のことが多い。
ひどい場合には水にDNaseがコンタミしたり、
我流で編み出したのか知らんがとんでもない実験手法をしていることもある。

148 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/26(金) 22:46:32
変性剤勾配付きのゲルでDNAの泳動をやる予定なのですが、
バンドの蛍光強度からDNA量を定量することは可能ですか?

二本鎖DNAの定量ルーラーは、変性剤勾配ゲルでは利用できなさそうなので
通常のPAGEと平行して実験すべきか迷っています・・・


149 :133:2005/08/26(金) 23:17:47
>>112
147を読み、まさかとは思いましたが、確認:

 洗い用のバッファ、使用前にエタノールを加えましたよね?




150 :147:2005/08/27(土) 12:36:24
例外:Stratageneのマニュアル

こいつだけは信用しない。

151 :112:2005/08/27(土) 15:44:25
皆様、厳しいお言葉ありがとうございます。

>>138  >>136
TBEは使ってません。TAEです。プロトコールどおり温めています。
透析チューブはラボにないので週明けに注文ですね。

皆さんのアドバイスされた点に気をつけながら、
もう一回キットを使ってみて、それでもダメなら、透析チューブやフェノクロを試してみます。
ありがとうございました。

>>142-143
やはりフェノクロが確実ですか。
フェノクロ使うと、何も知らないボスから「臭い!」とか「廃液が・・・」とか嫌味いわれるんですよね。
でもしょうがないですよね。そんなのには負けていられない。

>>147
リカバリ五割は確かにロスってますよね。
バンドの濃さではなく吸光度で量っているのも原因かも知れませんが、
根本的なところをもう一度チェックしてみます。

>>149
さすがに、エタノールは完璧加えています。ボトルにもチェック入れています。

152 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/27(土) 18:54:01
半分回収できたらいいんでないの?



153 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/27(土) 19:21:19
あの...ライゲーションでしょ。何でそんなに手間かけるの?
ゲルをつぶして浸み出した液を0.5ulも取ってそのままライゲーションに使えばいいでないの。
普通に数百個はコロニー生えてくるよ。

154 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/29(月) 21:02:32
定量性がない。よって使えない。

数字で表せないものはサイエンスではない。

155 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/29(月) 21:26:36
>>153
だいたいコンピのふえが悪いんだよ。途中のステップどんなにがんばってもコンピのふえが悪ければコロニーは生えず当たりにも当たらない。
コンピの増えは保存の温度が全て。 作るときに駄目なのは論外。

156 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/29(月) 21:57:36
>>148
DGGEの事ですか?
事前に吸光度測定などで濃度が分かっているDNA(E. coliとかでok)を
違うレーンに流して、染色後のバンドの輝度の比をとれば定量できそうだけど…
素人の考えなので自信はありません。


157 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/29(月) 22:17:09
>>155 コンピのふえ? 神部の笛みたいなもんか??
形質転換効率のことなら、それと分かるように書いて欲しいな。

158 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/29(月) 22:34:09
>>156
E. coliのDNAも変性して分離しませんか?
分離の仕方がわかってるなら、検量線を作れるかも知れないけど。
変性しなさそうなDNAを使えれば良いのかな。
でも、プラスミドDNAは蛍光強度の発光効率が直鎖DNAとちがうし・・・

159 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/29(月) 22:47:02
>>158
16Sr DNAの可変領域BをPCRで増やしてからDGGEすると良いらしいですよ。
そうすれば、バンドは1本になるらしいです。
ってか、PubMedでDGGE関連の論文けっこう出てるんで、参考にする事を
お勧めします。(Mayer et alとか)




160 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/30(火) 21:13:15
マニアックな解答ありがとうございます。
ようするに極端にGCリッチな二本鎖DNAをマーカーにすれば良いのかな。


161 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/30(火) 21:37:24
PubMedで探しましたがMayerという人のDGGEの論文が見当たらないので、
とりあえず、Muyzer et al.の論文からプロトコルの発展を辿ってみます。


162 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/30(火) 21:53:59
>>160,161
ウーン、自分が指導教官だったら濃度のわかってるプラスミドを適当なエンザイムで切って直鎖にして、
量を振って流せ、と言うかな。

厳密には>>159の言う通りなのかも知れないけど、所詮大雑把に濃度知りたいだけだし。
あまりキチッとやってると今度は時間が足りなくなる。

163 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/30(火) 22:06:06
あげ

164 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/30(火) 22:33:05
とりあえず、GCリッチな二本鎖DNAのPCR産物を
カラムで精製して、吸光度を測って定量マーカーにしてみます。
素人に丁寧に解説頂きまして誠にありがとうございました。

165 :133:2005/08/31(水) 01:29:57
>164
定量マーカーって、、、、dsDNAでメチャ厳密にするわけでもなければ、
NEBのラダー使ったらどうですか?
ラダーの各バンドの質量もカタログに書かれてますし。

166 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/31(水) 07:45:38
変性勾配ゲルだからdsとssの両方のバンドが出ちゃうので困るって話でしょ。

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