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7kbのサブクローニング! 緊急質問!

1 :Me:2005/06/15(水) 21:46:06
7kbのゲノムPCRで増やしたインサートと低コピープラスミド(5kb)をEcoR1,Not1で切って(overnight)両方ゲルから切り出して
(抽出を流して確認ずみ. GeneCleanU)、T4 ligaseで
ligationして(vecter 80ng,insert,150ng)コロニーがネガコン
より多く(10個(ネガ)、24個)、20個とってミニプレしたら、
セルフがうち3つほどで、あとは、まったく別の(3kbほどの)ベクターなどがでました(2種類の制限酵素で確認)。エチブロ染色のときは毎回新しいTAEを使っています。コンタミでしょうか?それとも低コピープラスミドなので、コロニーがでにくいのでしょうか?

2 :緊急応答!!:2005/06/15(水) 21:50:26
単発スレ立てんなくそボケ!!
逝って良し!

3 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/15(水) 22:12:44
制限酵素処理はovernightする必要ないし、プラスミドはゲル精製する必要も無い。
10kbpを超えるプラスミドの形質転換効率は非常に低い。
インサートの量が少なすぎるだろ。モル比でinsertを10倍ぐらい入れてみろ。

EcoRIはスター活性が高いんだから、時間も酵素量も必要最小限でいい。
セルフライゲーションが気になるならEcoR1とNot1の間を切る酵素も少し入れて
digestionしろ。

4 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/15(水) 22:14:22
PCR産物は一度TOPOとかTAクローニングしてプラスミド調製してから
普通にサブクローニングした方が失敗が少ないと思うぞ。

5 :Me:2005/06/15(水) 22:39:33
>3 実は、字数が多くなるので書かなかったんですが、モル比は
1:1から1:10までふっています。
あと、スター活性がかりにおこったとしてもそれははいらないと
思いますが。

>4 TOPOのTAクローニングはそれ専用の PCR enzymeを使って
以前したことがあるのですが、mutationがたくさん入っていて
やめました。今はLA Taqを使っています。


6 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/15(水) 22:46:27
まあ7kはなかなか入らないな
ころPもかかりにくい

あきらめて96クローンぐらいミニプレして
Eco1とNot1でインサート確認しる


7 ::2005/06/15(水) 22:48:27
追加
長いインサートが入ったクローンはなかなか生えてこない

小さめのコロニー優先で拾うこと


8 :Me:2005/06/15(水) 22:50:40
すいません。結局、セルフライゲーション、もしくは
短いPCR産物がはいったなら納得いくのですが、
ほとんど、別のベクターだというところがよく分からないのですが・・・。

9 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/15(水) 23:00:59
コンタミだろ
コンタミのソースは不明だが

10 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/15(水) 23:03:06
スター活性でベクターが短くなって,それがセルフで短いプラスミドが出来たんじゃないか?
ゲル回収って万能じゃないよ
たいてい見えない量のDNAはコンタミしてる

11 :Me:2005/06/15(水) 23:06:57
>9
もちろん、いろいろ考えました。
基本的にゲルでながして精製しているので、そのあとの段階
でのコンタミが考えられます。
泳動装置、エチブロ染色槽、ともにきれいに洗いました。
気になるのは、GENEclean kitが2年前のものをつかっていますので、
その間に、NaI や、 New wash などの容器にコンタミしたのかな?
とも考えています。(現在購入予定です。)
それ以外の原因は考えられないでしょうか?
それ以外の別の原因の気がするのですが・・・

12 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/15(水) 23:10:59
>>11
だから>>10でも書いたが,電気泳動って完璧に分画出来るわけじゃない
そうすると違うサイズのDNAもどうしても混じってしまう
スター出て短くなったヤツも狙った5キロのバンドにちょっと隠れている
それごとゲルから切り出してるわけだから,ligationにもコンタミしてしまうでそ

13 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/15(水) 23:11:03
長いDNAをクローン化する場合、DNAによりベクターとの相性が出てくるので、
色々なベクターを試してみるのが良い。10kbなら、意外にpBR322が良い。

14 :Me:2005/06/15(水) 23:12:24
>10 EcoR1はスター活性は確かにでますが、それはライゲーション
されないのでは?(相補しないとおもいますよ。2箇所切れれば別ですが)
あと、スター活性のセルフとは考えられないのは、例えば、制限酵素で
切って、4kbと2kbとかのバンドが結構でたりします(3.5kb
と11.5kbがでるように切っているのですが)。
どうでしょう?

15 :Me:2005/06/15(水) 23:15:56
>13 pBR322とは、使ったことないのですが、
違うベクターがだめなとき、試すといいことが結構あるという
ことでしょうか?
ちなみにこれはコピー数が高コピーでしょうか?
現在、手元にpBluescriptがあるのでこれで試そうとも考えて
います。

16 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/15(水) 23:28:06
15> 異なるなるベクターを試すことはよくある。pBR322は、昔、レトロウイルス(約10kbはある)をクローニングするのに良く使われていた。コピー数はpUCより低い。
まずは手元にあるベクターで試してみるのが良いと思います。

17 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/15(水) 23:28:15
ゲノムをサブクローニングするとき、まま起こる現象だと思います。
繰り返し配列を含んでいたりとか。
私の場合、stbl4等を使いました。

18 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/15(水) 23:30:36
17>
文章がおかしくなってすみません。

私の場合、ホストの大腸菌にstbl4をつかうことで
改善しました。

19 :Me:2005/06/15(水) 23:33:36
>17 ゲノムをサブクローニングするときとは
ようするにインサートが様々な長さに切れるということでしょうか?
だとするとベクター側の配列は変わらないわけですね?
しかし、ベクター側が、ぜんぜん関係ない長さのベクターがでるのですが。
どういうことでしょうか?

20 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/15(水) 23:59:37
EcoRIのスター活性はN^AATTNを切るから、これも当然ligationされる。
ベクターのself-ligationで短いものが優先して取れてるだけだよ。

21 :Me:2005/06/16(木) 00:08:18
>20それにしても、5kbのところを切り出しているわけですから、
多少、スター活性のものがまざるのは分かるのはわかるのですが、
ほとんど、スター活性ベクターのセルフだなんて??
あと、さっきも言ったとおり2kbと4kbのように短いベクター
んぼセルフ以外のもののほうが多いんですよ。

22 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/16(木) 00:12:47
ゲルから抽出した断片を泳動して確認済みなんだよね。それ、よく見るとバンド
の下にうっすらスメアしてるだろ。Genecleanで長い断片(含ベクター)を精製
すると、DNAがグラスミルクの複数の粒子にまたがって吸着されるチャンスが
高いせいで、物理的にちょん切れるんだよ。もちろんendの構造もバラバラな
mixtureになるからself-ligationの効率は決して高くないけど、この例みたい
にinsertが長いとその効率が低いからバックが無視できなくなる。

23 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/16(木) 00:18:55
無理!!
すなおに、二つの断片に分けたほうが早いよ。

24 :Me:2005/06/16(木) 00:19:55
>22 うっすらスメアだとか ちょんぎれるとか、
ちょんぎれる率のほうが正常なものよりも多いのであれば、
GeneCleanはキットとして失格なのでは?
うっすらスメアは、うっすらでしょ? 少しはでるのなら分かるけど?

それより、だれか、低コピーベクターを使って、同じような経験
のある人ぜひ、いらっしゃったら教えて下さい。
この可能性を今一番、考えています。

25 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/16(木) 00:29:04
1) TA cloning
2) using another vector
3) incubate @ room temp.

26 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/16(木) 03:15:07
>>1さあ
君、ラボでもこのスレッドみたいな調子だから
相談する相手がいないんでしょ。

結構みんなまともなこと言ってくれてるのにスルーしてるだろ。

素直に一度PCR産物はTAクローニングしろ。
LA taq使ってるんだろ?


27 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/16(木) 07:49:43
>>24
GeneCleanは既に時代遅れだね。
どうせ使うならQIAGENのゲル精製キットみたいにメンブレンタイプの方が>>22のような問題を起こしにくいと思うよ。

28 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/16(木) 08:10:54
Not1がくせものなんじゃないか?

5末側に10ベースぐらい余分な配列を置かないと切れが悪い

29 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/16(木) 08:11:07
Not1がくせものなんじゃないか?

5末側に10ベースぐらい余分な配列を置かないと切れが悪い

30 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/16(木) 08:13:17
サブクローニングのときは、制限酵素処理2時間だろ。
O/Nなんかするからおかしくなる。

7kbのクローニングもやることあるけど、
2chで単発すれ立てて議論するような問題じゃない。

31 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/16(木) 08:38:39
LA-taq使っているんだったら A-tailingの効率はわるいから
TA-cloningの効率も悪い。
>>26
えらそうにまちがったこと教えるんじゃねえぞ。
むしろPCR産物に、QUIAGENのA-tailing kitを使って
きっちりAをくっつけてから、Invitrogen TOPO-TA
を使ってcloningするのが効率がいいはず。
(ただし試薬高いが)

>>30
2chで単発すれ立てて議論するような問題じゃない。
同意。

32 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/16(木) 08:42:48
>>24 Genecleanがキットとして失格だとは思わないが、
オマエが研究者として失格なのは間違いない。

人の意見を聞く耳持たないなら、こんなところで聞く意味無し、だ。
いつまでも一人で苦労しろ。

33 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/16(木) 08:42:52
断片調製に電気溶出してるヲレは逝ってよしですか?

34 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/16(木) 09:01:39
ローコピープラスミドというのはこの実験で何の問題にもなりませんな

35 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/16(木) 09:28:21
テキトーな実験やっといて上手く行かないと
すぐに共通試薬がコンタミしてるーって騒ぐ奴、いるよね。

36 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/16(木) 09:40:00
さすがにこのスレにはド素人は書き込まないようだな。
だったら捏造話も、ここでしようぜ! (w

37 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/16(木) 09:41:26
どうも>>21>>1は勘違いしているようだが、ここで言ってるself-ligationは
完全長のベクターのそれではないよ。ベクター中のoriと薬剤耐性遺伝子さえ
あれば大腸菌で増えるんだから、starだかスメアだかでそれを含む短い断片が
含まれていて、それがself-ligationで環状化すればサイズも小さいせいで
10kbを超える産物に比べれば形質転換効率もずっと高いもんだから、量としては
少なくてもこれが優先的に取れてくる。

38 :Me:2005/06/16(木) 09:57:12
眼が覚めてスレみてみると、
もう少し、まともな経験ある人の意見
があると助かったんだが・・・
まあ、いいか。

39 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/16(木) 10:28:00
まあ、Meはお礼を言うどころか、38の発言でみなを敵に回したなw。
というわけで、放置が一番だが、老婆心から経験者として教えてあげる。

そんなお行儀の悪いDNAはあきらめなさい。Targeting vectorでも作ろうと
してるんでしょ。それだとこのクローニングで終わりじゃないでしょ。
変なことして時間を無駄にするより、ストラテジーを変えたほうがいいよ。

これまでであったお行儀の悪いDNAは、300bpほどでも駄目だったな。
素直なやつは、7kbでも問題なし。

40 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/16(木) 11:47:45
まあ、高々7kbのサブクロも成功させられないDQNだから仕方ないだろ。

41 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/16(木) 16:26:51
>>5を見ると、PCRのやり方もキットの原理も理解できないdqnであることは明白だなw

42 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/16(木) 23:37:58
MeはバカMeのMe

43 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/17(金) 09:18:13
スレタイの2つの「!」からしてハシャギ過ぎ

44 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/17(金) 09:28:21
ローコピープラスミドってどういう意味で使ってる?
pUCやpBluescriptみたいなハイコピーに対比してpBR系のものを言ってる?
それともpSC101みたいなホントのローコピーのstringentプラスミド?
後者なら選択のための抗生物質の濃度を薄くしないとほとんど生えないよ。

45 :Me:2005/06/17(金) 12:26:10
やっぱり2chは使えない奴が多いな。
とりあえず、終了します。
糞スレたてて申し訳ないが
どうせおまいら暇人だからいいよね。

46 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/17(金) 12:50:38
>>45
自分で削除以来出しておけよ

47 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/20(月) 13:04:12
かつて、うちのポスドクが、ca. 10 kb の mRNA を逆転写 & PCR して、発現ベクターを
作ったことがあります。この時の手順ですが、
まず、変異が入りにくいといわれるポリメラーゼを購入し、それでPCRを行なう。

市販のT-vectorを使って、TA-cloning
(この時、制限酵素処理して直接ベクターに挿入しようとしても入らなかった。)

コロニーPCR(プライマーがはいっており、鋳型が入っていないPCR反応溶液
に、コロニーを懸濁し、1サイクル目に94℃で5分インキュベーションした後、
そのまま通常のPCR反応を行なう。このとき、マスタープレートとして別のプレートにも
植菌しておく。)

電気泳動により、インサートチェックを行なった後、プレートから液培に植菌し、
miniプレ&シーケンス

7KBなら必ず1箇所以上は変異が入るので、変異した部分でプライマーを作成し、
プラスミド一週分伸長するか、切り貼りするなどして、変異を無くす。

切り出して、ベクターに挿入。このとき、ベクターは絶対ホスファターゼ処理する。



ということで、まず、PCR産物をTA-cloningして、コロニーPCRする所から
始めましょう。

48 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/20(月) 13:31:05
プライマーの設計
  制限酵素は、6塩基の特異的な配列を認識し、切断しますが、このとき、
  制限酵素サイトの両端より外側に2,3塩基余計な配列がないと切ってくれません。
  そのため、プライマーを設計する時は、5'末端に更に、3塩基ほど適当に付加した
  配列を設計します。また、Taqは、3'末端にAを付加しますが、この時、Cに付加
  し易い傾向がありますので、各 primerの5'末端はGにしておくのがよいでしょう。
  とりあえず、
  GTT-[restriction site]-[gene specific sequence]
  という配列の、Forward primer、Reverse primerを設計してみて下さい。

PCR
  PCRは、25サイクルまでにしておきます。

TA-cloning
  T-vectorとインサートのモル比が1:10の比になるよう混合し、ligation highは高価
  なので、トータルのDNA溶液量の半分量を添加する。そして、一晩、16℃で
  インキュベーションした後、形質転換を行なう。

コロニーPCR
  面倒臭くなってきたので、また後日。

49 :Me:2005/06/20(月) 14:20:58
>>47
有り難いのですが、助手の先生がやってくれることになったのでもういいです。
それにそのくらいのことはプロトコール本に書いてあるし。

50 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/20(月) 15:03:35
ということでMeは助手の先生から「使えない学生」と認定されますた。


51 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/20(月) 16:01:39
>>50
プロトコル本に書いてあることとないことの区別もつかないレベルの学生だしねえ

Me君は間違っても院生になろうなんて思わないでね。
これ以上駄目院生に増えられても困るからさ。


52 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/20(月) 16:56:58
>47
Hi-fidelityのDNA polymeraseって3' terminal transferase活性が無い・低いものが
殆どじゃないでしょうか?
(っつーか、3'->5' exo 活性があるからこそのHi-fidelityなんだろうし)

それなのに、TAクローニングなんですか?

#Blunting -> リン酸化 したベクターに入れる方が吉のような気も…

53 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/20(月) 17:15:55
しっかし、このスレ主、他人に質問する時の態度なっとらんね。
「まともな」「まあ、いいか」(>38)とか
「そのくらいのこと」(>>49)とか

プロトコル本とか偉そうに言ってるが、Y土社とかの本の事なんだろうね。
CSHLの3分冊のアレくらい読んでるのか?

54 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/20(月) 17:19:33
>>27
確か、QIAGENのメンブランカラムの奴は4kbを越えると回収率が落ちると取り扱い説明書に
記されていた記憶が。

自分は、6kb程の切断後のベクター断片の切り出しはQIAEXII(シリカビーズ)でやってます。


55 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/20(月) 18:40:49
サイズがでかいと本当にサブクローニング難しい.
なんか,コツとかない?
ちなみにベクター7.4kb,インサート5.9kb

56 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/20(月) 19:32:03
ベクターの制限酵素処理の後、電気泳動切り出しはせず、heat inactivationするだけ。
もしセルフライゲーションが嫌ならもう一カ所切断する。

アガロースゲル切り出しをするとライゲーション効率が下がる、と感じられる。

57 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/20(月) 19:41:56
>56
Phe/Chloならばよいの?
制限酵素2つ(double不可)ないと切り出せないので.

58 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/20(月) 19:52:31
>>55
切り口変えればだいたい入るだろ。

59 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/20(月) 20:07:41
こういう変な学生はときどきいますね。
はやく卒業してくれと思いますね。

60 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/20(月) 20:20:06
>56
切れ端の除去はどの様にしておられるのでしょうか?>57さんの書かれたように
フェノール・クロロホルム抽出でしょうか?(でも、どうせフェノクロするなら
熱かけないよなぁ)

61 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/20(月) 20:42:59
切れ端の除去など必要ない。だいたい、ベクターに対してインサートは
モル比にして3−10倍入れるだろうが。3カ所で切れば、熱処理しただけで
ライゲーションに持っていけばいい。

62 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/20(月) 21:16:12
>58
リンカー付けなきゃ無理.
>61
ベクター側の断片(インサート)内にもう一カ所ってこと?

63 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/20(月) 22:54:37
切り出しで効率が落ちるのは、
1)アガロースの持込み
2)UVによるDNA障害
3)cohesiveエンドの分解

64 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/21(火) 11:14:16
アガロースからの切り出し精製ではDNA断片を電気溶出した方が効率は良かったようながする。

65 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/21(火) 12:32:22
ベクター側を脱リン酸化すれば、効率は上がります。
やり方は簡単で、制限酵素処理反応溶液に、一緒に
牛由来アルカリフォスファターゼを4unit入れます。
このとき、DNA1μgに対してアルフォス1 unit入れます。

例)
MilliQ                −
DNA sol.           2 μg-DNA
10*NEBuffer         5 μl
Enzyme A           1.5 μl
Enzyme B           1.5 μl
alk phos (Amersham)   2 μl (2 unit)
BSA              0.5 μl
________________
total             50μl



66 ::2005/06/21(火) 12:33:19
37℃ 一晩

ゲル回収

67 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/21(火) 14:47:03
Meは普通のサブクローニングで20個しかコロニーがでてないんだから、
ベクターのCIP処理なんかしたらコロニーでてこないよw

68 :55:2005/06/21(火) 17:23:12
例えば,6kbのベクターに2kbのインサート
入れるんなら,コロニーは一面に生えるよね.
でも,10kbに2kbとか,7kbに5kbの場合,同じ
条件でも効率が極端に下がるわけ.もちろんCIP
はかけてるよ.
で,なんかtipsはないかと..

69 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/21(火) 20:19:20
普通のコンピテントセルでは10kbを超えるプラスミドの形質転換効率は非常に悪い。
サイズの問題ならエレクトロポレーションでもしたら?

70 :& ◆cIYxGPRRGA :2005/06/21(火) 21:40:03
エレポでポン

71 :55:2005/06/21(火) 22:36:47
>69
TFの問題?
ライゲーションそのものは問題なく行ってるの?

72 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/21(火) 22:55:42
>>69 どんなに悪いったって、1/10ってことはなかろう。別の理由だと思われ。

73 :Me:2005/06/22(水) 00:44:12
なんだ、久しぶりに見たら、みなさん怒ってスレ削除
などなっているかな、と思いきや、まだ続いているんだ。
スレたてて、よかったじゃん。

74 :55:2005/06/22(水) 02:01:57
>69
だって,12kbのベクターだってライゲーション無しで
直接入れたら,いっぱい生えるよ.

それと,NEBのプロトコル通りCIPかけてもserfがいっぱい
出来るんだよね.他のphosphateseのほうがいい,ってことある?

75 :55:2005/06/22(水) 02:05:13
serfじゃなく.self.

76 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/22(水) 06:23:49
バカ

クローズドサークルのプラスミドとニックのはいったオープンサークルで形質転換効率はまったく違うがな

77 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/22(水) 09:06:02
クローズドサークルとオープンサークルで形質転換効率が違わないなんて
誰も言ってないだろ。サイズによる形質転換効率の違いが、両者で違う
なんてデータあんのか?

78 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/22(水) 12:59:08
> ライゲーション無しで直接入れたら,いっぱい生える

それって、ベクターの制限酵素処理が不十分ってことか?

79 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/22(水) 19:45:58
日本が不自由な香具師の相手をするのは時間の無駄

80 :55:2005/06/22(水) 19:47:02
>78
そうじゃなくて,クローズドサークルのベクター
なら,サイズがでかくてもTF効率は十分ってこと.
他からベクターもらったときとかするでしょ?

それと,でかいベクターでもブラントエンドにして
リンカーだけ入れてライゲーションした場合たくさん
生えるな.
インサートがでかいとライゲーション効率が異常に
落ちるように思われるんだが.

81 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/22(水) 19:50:45
そりゃセルフライゲーションは0次反応だからぁ、、、
ベクター+インサートは二次反応だろう。

82 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/22(水) 23:04:40
gateway世代になったら、だれも普通のサブクローニングできなくなるyんぢゃないか?

83 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/22(水) 23:49:39
セルフライゲーションは0次なら、
ベクター+インサートは限りなく1次だろ。

84 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/23(木) 03:16:29
サブクローニングを笑うやつはサブクローニングに泣く


85 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/23(木) 19:49:46
切り貼りを覚えただけで、エラそうにしんじゃねぇ!

86 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/25(土) 14:27:35
切り貼りごときと俺も思うが
切り貼りも満足にできない香具師が多いのも事実。



87 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/25(土) 14:37:41
名前が違う制限酵素は切り口も違うと思い込んでいる香具師がいてこまる。

88 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/25(土) 17:43:15
>>87
違うだろ-なーと思うけど一応調べる。
思い込んで調べない香具師多くてゲンナリ。

89 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/25(土) 18:15:13
>>88
マヂですか?
……漏れは師匠に感謝しとこっと。(気付けば、実験台と自宅とにNEBカタログなどなどがduplicate状態)

90 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/25(土) 21:03:56
XbaIと切り口が同じ酵素は意外と多い。

91 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/26(日) 06:04:40

>Me

へたくそ

92 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/26(日) 06:06:31
助手・・・簡単に出来る
Me・・・できない。

=Meへたくそ

93 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/26(日) 22:15:05
>>89
自宅にカタログ !? 家でそんなの読んでるの? まさか !!

        −  一家に一冊 試薬カタログ  −


94 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/27(月) 22:09:05
SalIとXhoIが一緒だったような(遠い目

95 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/28(火) 16:02:13
昔のことだが、EcoRIとかBamHIとかHindIIIとかの主要酵素の
切断配列を記憶してる香具師がいてまだ学部生だった俺は
そいつのことを密かに尊敬していたのだが、
今となってみるとどうでもいい知識だな...

96 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/28(火) 16:04:50
若いころは、自宅に大腸菌培養装置あれば
家で植菌できるなんて阿呆なこと考えたものだ。

97 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/28(火) 16:51:18
浴槽に 2×YT を張って,バブルスターで攪拌しながら,37℃ で一晩培養.
翌日には,一生かかっても使い切れないぐらい大腸菌が増えてます.

98 :89:2005/06/28(火) 20:31:41
>>93
いや、マヂです。
気づけば、休み明けの実験プロトコルをチラシの裏に書いたり、、、、
>実験廃人まであと少し(ウツダ

>97
全部コンピテントセルだったら嬉しいね。:p
200Lの浴槽でlog phaseの終わりだと仮定してどれくらいの菌量かな?

99 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/28(火) 20:54:04
廃棄された実験機器(完働品)や古いガラス/プラスチック器具(未使用)をせっせと家に持ち帰って貯め込んでた方がいた。

100 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/28(火) 21:58:49
Vortex 持ち帰りました.
バイブの代わりにしています.

101 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/28(火) 22:00:49
あっ 気づいたら100げとしてました.

102 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/28(火) 22:35:53
>>98
3kgぐらい取れるんじゃない?

103 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/17(日) 09:27:29
後で読むから、ageとく

47さん、ありがとう

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