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タンパク質の精製3

1 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/03 15:18:14
タンパク質の精製についての情報交換をするスレ

前スレ
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1039524190/
前々スレ
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/982464137/


2 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/03 15:19:05
前スレが落ちていたので立てました。
今年も頑張って精製していきましょう!


3 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/03 15:46:33
>>1


4 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/05 17:15:00
培養細胞上清由来の蛋白質を分画し、個々の蛋白質をそれぞれ多量に得たいと思っています。
和研薬のプロメテウスやATTOのプレップフォレーシスの使用を検討しているのですが、
これらの機器の性能について、実際に使っている人の感想を知りたいです。
また、プロメテウスやプレップフォレーシス以外で、蛋白質の分取に適した機器は
無いものでしょうか?

5 :& ◆BUllWavixk :05/01/07 12:20:57
質問すます。
精製後プロテインのバンドをとったら、分子量のでかいバンドがでますた。
普通こういうのはどうやってどのタンパク質かを知りますか。
ゲルを切り取って、トリプシン処理の後、枡?
それともアミノ酸シークエンス?
タンパク質がDBにのっていなかったらどうしようか、
枡は高いのか、アミノ酸のシークエンスとどっちがいいのか、
教えて下さい。

6 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/07 20:53:25
俺だったらシーケンスするかな
 俺のは未知だから全長遺伝子とってようやく少し特徴が見えてきた

7 :退役水兵:05/01/07 22:30:44
>5
シーケンスが確実と思うが、N末端がブロックされている可能性もある。
貴重なサンプルを無駄にしたくないのなら、
シーケンサーとマスの両方を使うのが良いのでは?

もしPVDF膜転写後のサンプルをつかうんだったら
染色/脱色に使う溶液に、氷酢酸を使わないほうが良いかと。
N末端部がアセチル化してしまうかもしれんから。

では、がんがってくらさい。成功をいのってます。

8 :5:05/01/08 01:06:21
>>5,6 ありがとうごじます。も少し教えて下すい。
・本なんかではPVDF膜が一般なのですが、Nitrocelluroseは可能でしょうか。
・未知タンパクであることは、どのように知ったのでしょうか。
幾つか取ったフラグメントをDBで検索して(BLASTでしょうか)、
見たのでしょうか。タンパク質が2量体であることは考えましたか?
・未知であることを知ったときの感想は?キターーーーですか?
・MSをどこぞに依頼するとどの位お金が取られるのでしょうか。
・MSでは全Peptideが取れないと聞きましたが、今は機器の性能向上に
向上しているでしょうか。回収率は何%?

とりあえず、N末端のブロックは無視してMS&シークエンスしてみるのかな?


9 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/09 23:06:26
>>6
スタンダードな方法と思いますが、
HPLCカラム精製を行った後に、
一気にMSに持っていきます。

10 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/09 23:23:52
MSは7,8万だったけかなぁ

11 :逆質問:05/01/09 23:25:40
MSで全ペプチドが取れないって何のことを言ってるの?


12 :5:05/01/10 07:26:23
>>11
あーいやー、私バイオ初心者なんですが、
ゲル内トリプシン処理でうまくペプチドがゲル内から遊離しない場合がある
MALDIでイオン化されないペプチドが考えられる。トリプシン自体の自己
分解があるの3点がすべてのペプチドが取れるわけではない、ということです。

また質問してしまうけど、多量体ってどうよ?1次元から2次元で
重なったバンドを分けるとモノマーの確率が高くなると思うんですが、
1次元の場合の成功率はどんなものでしょうか。

13 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/10 11:30:25
>5
ニトロセルロースはだめっしょ
未知であることはデータベースで確認 ある程度ホモロジーがあるタンパクは存在するが
普通に考えて違うタンパクだった
BLAST検索って工夫しないと引っかからないとき多いよ
N末ブロックされていたらAc-DAP(Takara)使いな
うまくやればラダーシーケンスもできるかも

俺がPVDFでプロテインシーケンスするときは
DTT還元後SDS-PAGE, Blotting
染色、脱色(50%MeOH)
PBS中でピリジルエチル化 洗浄(50%MeOH)
100% アセニト洗浄 乾燥
こんな感じでやれば試料のロスが少ない
アセニトはCBBが除けて脱水もできる、 やらなくてもいい

やはりアルキル化はやったほうがいいよ
ピークが全然違うから 

14 :逆質問:05/01/10 12:35:34
>>12
量がたくさんあることよりも純度がポイントでPAGEやる前にいくらかでも精製できればかなりの確立でタンパク同定できると思う。
MSは多くのペプチド断片配列の総和から元のタンパクを同定するので、
出る結果としては例えば、
Aタンパクのペプチド300個
Bタンパクのペプチド10個
Cタンパクのペプチド2個
ていう風になって
じゃあAだろうな、って分かって以降の確認実験に進んでいくわけです。
なので、BやCのコンタミを少なくできれば取れるペプチド数が少なくてもいいわけだし、
コンタミが多ければA由来のペプチド数がBやCを遥かに凌駕しないとわけ分からない結果になるんです。

したがって僕は回収量を気にするよりも軽く分画するなりして少しでも綺麗にすることをお勧めしたいですね。

15 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/10 12:42:24
ちなみに精製って分子量や等電点だけでなく
疎水性やアフィニティなんかでもできることがあるので
お忘れなく

16 :5:05/01/10 15:18:51
>>13-15
レスがついて良かった、ありがとうごじます。
精製はアフィニティを最初にやったYO!

吸収見たらなんか26まで取れたんだけど、
RNaseやDNase使うことってある?


17 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/11 01:05:26
おまいら、Amiconとかって使い捨てですか?
何回くらい使い回せる?

18 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/11 08:35:17
>5
何言ってるか分かりにくいです。
精製にDNase使ったこと有るかという意味だったらあります。

>17
やぶれるちょっと手前まで。

19 :5:05/01/11 10:15:04
>>18
Rnaseの活性って20度近辺だと思うんだけど、
精製は4度でいつもやっています。Rnaseはちゃんとはたくかな?
プロトコルとっかにあったら嬉しいのですけど。
260nmの吸収が減ることをきぼん。

20 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/11 11:50:03
まじめに質問しているのならばちゃんとした文章で書いてくれ。
あんたの文章、ほとんど意味不明。理解できん。

21 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/11 12:41:16
>>20
そのくらい読めるだろ。>>20は頭が悪いだけ。

22 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/11 15:15:16
>>21
読めるんなら5の文章を正しい日本語に訳してくれ。

23 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/11 19:27:45
俺も>>19の意味がわからん。
4度で何かを精製してるときにRNaseを効かせたいんだな?
それで何のプロトコルが必要なのよ?
260nmの九州が減るのを希望してるみたいだけど
わけがわからん。
っていうことで>>21の発現が56サブー。

それと基本的な疑問なんだがRNAって分解すると
260nmの値って下がるんか?


24 :& ◆/p9zsLJK2M :05/01/12 11:41:10
>>23も漢字が間違っているじゃないか。)w
日本語も変だし。

25 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/12 14:40:42
じょじょに日本語勉強のお時間になって来たな。
おれは23の文章はだいたい読めて理解できるよ。漢字も想像できるし。
>56サブー
ってのだけがわからんけど、2ちゃん用語ですか。

それに比べて5の文章はほとんど理解できないので、もう一度書き直すか21に正しい文章に翻訳してもらえ。


26 :実験好き:05/01/12 23:15:05
Ni-NTAをregenerationして使ってみたら全然タンパク引っ付いてない。ショック、明日メーカーに電話しなくっちゃ!


27 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/12 23:55:54
26さん
私、regenerationした担体を何度使ったか分からないですが毎回再生できてましたよ。。
キアゲンのマニュアルにのっとっていたんですが。

28 :実験好き:05/01/13 00:08:25
>>26
俺もキアゲンのプロトコールでやったよ。だいたい1時間くらいかけて全部通したんだけど早すぎ?


29 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/13 00:19:38
私の場合はオープンカラムにNi-NTAを1 ml充填してNi-NTAカラムを作製していました。
HPLCにつないでいたわけではないので26さんがどのような状態で担体を再生したか分かりませんが
私はニッケルがrechargeされているかどうかが不安だったので、硫酸ニッケルでrechargeさせるときに通すだけではなく、長時間放置していました。
1時間では終わらなかったおぼえがありますね〜。

30 :実験好き:05/01/13 00:32:06
>>29
俺もオープンで1ml充填してカラム作ってました。有用な情報ありがとうございます。早速明日ためしてみます。もしかしたら可溶化に使ったSDS(0.5%)のinteractionが原因かもしれないんですけど。


31 :実験好き:05/01/14 22:57:55
やっぱりSDSが原因でした。先生がやれって言ったからやってみたんだけど・・・。こんなんじゃだめだなorz


32 :  :05/01/15 07:38:44
先生がやれって言ったからやってみた だって。僕いくつ?

33 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/15 12:55:10
>>32
先生に命令されて1度やってみるのは、
別の意味で大事なステップだと思う。

>>5 周辺の人へ…
タンパクのバンドの同定は
MS/MSが一番でしょ。

34 :実験好き:05/01/15 15:39:07
>>33
ごますり野郎か、いやな感じ。

35 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/15 16:02:04
教官に指示された方法と自分が正しいと思う方法とを両方やるんだよ。
どっちが成功してもうまいところに落ち着くからね。

あまりにもアフォな指示を出す教官だったら上の方法で卒業までやり過ごしたあと
見限ってさようならする。これがうまい身の処し方だなあ。

36 :実験好き:05/01/15 22:41:10
>34は偽者です
>35
アドバイスありがとうございます。これからはそうしようかと思います。普段はそんなに変じゃないんですけどね。なぜか最近の指示が変なんですよ。次は0.1%SDS可溶化しろっていうし(SDSのCMCは0.2%くらいだったはず
)

37 :実験好き:05/01/16 01:29:12
でも、やっぱり先生のいうことだから従わなくてはいけないですよね。
私は学生なんだし。

38 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/16 01:46:14
>>35
禿同。

>>36
Ni-NTAのマニュアルにはSDSはお勧めできなくて、
0.3%までならOKかも…ってある。
そもそも…、
何の精製してるか知りませんが、
SDS可溶化なんかしてていいのかも気になります。

39 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/16 01:46:17
先生が何かどこかでうまくいきそうな情報を仕入れてきた
んじゃないかとおもいますけど?
SDSのかわりにサルコシル(N-lauroyl sarcosinate)も平行
して試すのはどうですか?
でもって可溶化したあと、シクロデキストリンでdetergentを
洗い流すという技が一昔前のトレンドでしたけど。
サルコシルとか巻き戻しとかのキーワードで検索するのもいい
かもしれません

40 :& ◆RPcwdTHODI :05/01/16 10:44:24
>>37=36
なんか主体性が随分ない学生だな。

41 :初代スレよりコピペ:05/01/16 11:40:20
30 :生化学師団蛋白精製大隊最先任軍曹 :2001/02/20(火) 06:34
>29

あらゆるプロトコルがキット化され、女子中学生がPCRでもサザンでも
シークエンスでもできるようになってしまった現代の分子生物学。
俺たちが青春を捧げた研究も、いずれコギャルがケータイ片手に
ブラウズできるようになってしまうのか?

だが心配はいらない。唯一マニュアル化できない漢(おとこ)の戦場が、
蛋白質精製という無法地帯に残されている。敵(蛋白質)が変われば
武器(精製法)も変わる、過去の知識などあてにはならない、やってみなけりゃ
わからない、先にタマ取ったもん勝ち、情け無用のキリングフィールドにようこそ。

それでは新米兵士の君に、生き残るための教練書を哨戒、違った、紹介しよう。
「Protein Analysis and Purification」  Ian M. Rosenberg, Birkhauser
「Guide to Protein Purification」 Murray P. Deutscher, Academic Press
「Protein Purification Methods」 E.L.V. Harris and S. Angel, IRL Press
「蛋白質・酵素の基礎実験法」 堀尾武一、南江堂 <ちょっと時代遅れだけど。
あと、Amersham Pharmaciaが出しているクロマト関係の小冊子には全て
目を通しておけ。

42 :教練書入手先:05/01/16 11:41:55
http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/081763665X/
Protein Analysis and Purification: Benchtop Techniques
Ian M. Rosenberg (著) ペーパーバック版
U.S. 定価: $76.95
価格: ¥10,359
出版社: Springer Verlag ; ISBN: 081763665X ; (1996/11/01)

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/0817637176/
同 ハードカバー版
U.K. 定価: £120.00
価格: ¥24,989
出版社: Springer Verlag ; ISBN: 0817637176 ;

43 :教練書入手先:05/01/16 11:42:19
http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/0122135857/
Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology
(Methods in Enzymology Series, Vol 182)
Murray P. Deutscher (著)
価格:¥10,173 現在、在庫切れです。
出版社: Academic Pr ; ISBN: 0122135857 ; 182 巻 (1990/03/01)

http://www.amazon.com/exec/obidos/ASIN/019963002X/
Protein Purification Methods by E. Lynn Harris, S. Angal
Availability: Out of Print--Limited Availability
Publisher: Irl Pr; ASIN: 019963002X; (December 1996)



44 :教練書入手先:05/01/16 11:42:53
http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/4524401237/
蛋白質・酵素の基礎実験法
堀尾 武一 (編集)
価格:¥8,544
出版社: 南江堂 ; ISBN: 4524401237 ; 改訂第2版 版 (1994/11)

Amersham Pharmacia Technical Literature Database
http://www5.amershambiosciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/literature_intro

45 :教練書入手先:05/01/16 11:45:02
34 :HDD理論 :2001/02/20(火) 13:03
あとね。
英語の本ですけどAcademic Press社、N.C. Price編集
Protein LAB-FAX ISBN 0-12-564710-7
はコンパクトだけどいろんなことが書いてあってお薦めだよ。
>30
漢と書いておとこと読む、その心意気に乾杯

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/0125647107/
Proteins Labfax (Labfax Series)
N. C. Price (著)
U.K. 定価: £56.95
価格: ¥12,293
出版社: Academic Pr ; ISBN: 0125647107 ; (1995/12/21)


46 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/16 11:45:32
349 :名無しゲノムのクローンさん :2001/08/17(金) 18:56
どうも、横レスです.
僕はタンパク質工学に興味がある学生です.
大学院からタンパク質を学びたいと思っています.
今の講座はバイオしかやらないので、essensialとcellなどの教科書は読んでいますが、
タンパク質工学に関する本は読んでません.
タンパク質工学に関する入門テキストのようなものがありましたら
教えてください。厨房でした


350 :名無しゲノムのクローンさん :2001/08/21(火) 16:03
古典的名著
タンパク質工学の物理・化学的基礎 江口至洋 共立出版

あと
蛋白質機能の分子論 濱口浩三 学会出版センター

47 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/16 11:46:16
http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/432005377X/
タンパク質工学の物理・化学的基礎
江口 至洋 (著)
この本は現在お取り扱いできません。
出版社: 共立出版 ; ISBN: 432005377X ; (1991/05)

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/4762236179/
蛋白質機能の分子論
浜口 浩三 (著)
価格:¥3,400
出版社: 学会出版センター ; ISBN: 4762236179 ; 改訂版 版 (1990/02)

48 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/16 11:46:43
425 :名無しゲノムのクローンさん :01/10/15 16:02
横レスすいませんが、タンパク質工学を学ぶ上で参考になる本があったら、
ぜひお願いします。独学で学ぶ予定です。


426 :泥沼歩兵部隊 :01/10/15 18:56
古典的名著 江口至洋 「タンパク質工学の物理化学的基礎」
共立出版

これはいい本なのですが絶版になってどこでも手に入りません
もってる先輩で使ってないヒトから言い値で買う価値のある本
です。古本屋でみかけたら即ゲット

蛋白質機能の分子論 濱口浩三 学会出版センター
これも古い本ですが入門にはよいと思います。

蛋白質のフォールディング 原理・機構・応用
RHペイン シュプリンガーフェアラーク東京
最近ではタンパク質工学そのものへの興味よりも
フォールディング機構に切り口のある本によい本が
あると思います。お勧めです。もう何冊か、最近出て
いるフォールディング関係の日本語の本もいちどご覧ください。

最後に今年の8月の蛋白質核酸酵素の増刊
「新世紀における蛋白質科学の進展」ですが、玉石混交と
いってしまうには玉のほうが多い、日本の蛋白質科学も
レベルが高くなったなあと思わせる本だと思います。特に
若い人たちの書いているところがどれも粒ぞろいに面白
いです。入門には向きませんし、構造生物学が大分はいっ
てますが一応お薦めしておきます。



49 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/16 11:47:09
http://www.springer-tokyo.co.jp/content/isbn4-431-70953-3.html
タンパク質のフォールディング 第2版
R.H. Pain 著
崎山 文夫 監訳 河田 康志/桑島 邦博 訳
B5 並製 410頁 本体 6,000円+税 
ISBN 4-431-70953-3
CコードC3045  発売日 2002年10月11日

http://kyoritsu-pub.topica.ne.jp/pne/pne01z.html#shinten
新世紀における蛋白質科学の進展
中村春木・森川耿右・鈴木紘一・三浦謹一郎 編
392ページ/定価7,035円(本体6,700円)
ISBN 4-320-05588-8
『蛋白質 核酸 酵素』増刊号を書籍に改装



50 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/16 11:47:35
818 :泥沼歩兵部隊・後方戦闘支援室 :02/09/28 21:10
タンパク質物とり戦線、前線にて戦闘中の皆さま、いかがお過ごしですか?秋の学会シーズンを
控え、日々の戦闘もますます激化していることと思います。
さて、泥沼歩兵部隊後方戦闘支援室から、下記の書籍をご紹介させていただきます。
Protein Protocols Handbook
John M. Walker (Editor) (Paperback, 1147 pages - February 2002)
Humana Press; ISBN: 0896039412; 2nd edition (February 2002) 日本円で約15000円
タンパク質の取り扱いに関する良い教科書がないとお嘆きの皆さま、是非ご検討ください。
後方より諸兄らの武運を祈る・・・・オーヴァー

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/0896039412/

51 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/16 11:48:01
http://www.tsurumi.yokohama-cu.ac.jp/biophys/profile/hiroakih.files/refolding2002.pdf
蛋白質の(試験管内)巻き戻し法における最近の話題

http://www.virus.kyoto-u.ac.jp/Lab/MolGen/opinion_frame.html
上村さんの雄叫び@京都大学ウイルス研究所・上村研究室


52 :実験好き:05/01/16 12:22:19
37は偽者です。
>38.39
またまたアドバイスありがとうございます。現時点ではたんぱく質の活性がなくても構わないからとにかく精製しようというプランなのでSDSでもだいじょうぶなんですよ。
明日はこっそり非イオン性の界面活性剤を試してみようかと思います。試薬が高いから少しびびっちゃいますけど


53 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/17 01:39:36
Niカラム溶出後のフラクションを透析したらあぐった・・・・。薄めてから
透析するといいって聞いたことあるんだけどほんとなんかね?うそくせえ・・・・。

54 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/17 02:04:47
>53
急速希釈法じゃないの? 1mlくらいのサンプルを1リットルくらいのバッファーに
即効で加えたらいいのでは?

俺はアルギニンリフォールディングしているよ
0.4Mくらいまで2日くらいかけてゆっくり透析 それ以上濃度を下げると
アグリゲーションする Niカラム使えないのが痛い

55 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/17 16:31:19
53さん、私は0.5 mg/ml程度でアグリましたね、モノによって変わってくるでしょうけど。
それ以来、0.2 mg/mlくらいの濃度にして透析してますよ。
それでうまくいってますね〜。

56 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/17 16:37:26
54、55さん ありがとうごぜえます:; がんばってみまつ


57 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/25 16:27:00
すみません
研究室の最近使われた形跡のないHPLC用カラム(東ソーのTSK-gel G3000SWXL)
を使おうとしているんですが、カラムの耐圧をどなたかご存じないですか?
書類のたぐいは見あたらず、ホームページの資料にもないようだったので。。。
それから洗うときや保存するとき20%エタノールは使っていいのでしょうか?
おねがいします。


58 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/25 20:48:04
メーカーに電話して資料送ってもらえ。

59 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/26 00:24:32
ゲルろ過カラムだろうから2MPa できれば1Mくらいがいいはず
保存は20%エタでいいけど 今使っているバッファーと反応して不溶性物質ができないのを確認したほうがいいよ
心配だったら1N水酸化ナトリウムで洗ってちょ
平衡化は数時間やったほうがいいよ

60 :57:05/01/26 11:20:35
どうも。
結局知人に聞きました。
普通1MPaで使っているとのこと(ガードカラム分除く)。

ちなみにエタノール系と塩を含むバッファーを交換するときは間に真水洗いをいれてまつ。
あと、シリカが溶けるのが心配なのでTSKgelについてはNaOHは使わないことにしています。


61 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/26 22:05:10
質問させてください。
低pHのバッファー条件でアフィニティークロマトグラフィーを使ってリコンビナント
蛋白質を精製できないか考えているんですがどなたか情報をお持ちではないですか。
アフィニティークロマトグラフィーを使う場合今までだいたいHisタグ使ってきたん
ですが諸事情によりHisタグが使えない低めのpHを使うことになりそうだからです。
GSTその他のタグについても調べてみたんですが低いpHで使った例が見当たらなかった
もので。どなたかその辺りの経験をお持ちの方情報お願い致します。

62 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/26 23:11:58
GSTとグルタチオンの結合はpHに影響される。

63 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/27 21:30:19
アマシャムによれば6.5〜8.0だな。

その諸事情が何かによって方針が変わるなあ

64 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/29 20:50:49
スレ違いは承知で・・・
SDS-PAGE条件でほどけないタンパク質間の相互作用ってありますか?
あきらかにフュージョンした状態でバンドがあって、
LC-MS/MSで二つタンパクが同定されます。。。
なんででしょ。

65 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/29 20:57:26
ユビキチン化

66 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/29 21:00:40
>>64

例えばバクテリアアルカリフォスファターゼのZn結合タンパク質の2量体は非常に安定なので
サンプルバッファーを加えて50-60度ぐらいでは解離しない。

EDTAを加えて95度5分以上しないと単量体にならない。

67 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/30 00:31:02
SDS+還元剤+boil も万能じゃないよ
多量体形成したら上のほうにバンドが出る場合もそんなに少なくはない

68 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/30 00:48:37
64です
ありがとうございます。
分子量からして多量体ではなくて二種類のタンパク質が
1:1で結合しているように思います。
ユビキチン化はあるタンパク質にユビキチンが結合して分解なんかがすすむって奴ですよね?
これも異なる二種のタンパク質の複合体を形成しているようなので、
ちょっと違いそうですね。
う〜ん。。。
SDS-PAGE条件は67さんがおっしゃる条件でboilも5分程度してるのですが。。。


69 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/30 00:54:13
>>68>>66>>67のコメントの意味が分かってないみたいだね。
どちらもSDS dyeでboilしても結合が解離しないタンパク質だってあるよって言ってるんでしょ。

70 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/30 00:59:10
>64
もともと2量体の大きさのタンパクでMSの操作が悪いとか。
MSは違うピークが出ることもありうる

>61
我慢して陽イオン交換カラムを使いなさい

71 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/30 01:07:43
共有結合でないなら、6M尿素入りのアクリルアミドゲルで泳動したら
どうなのよ?解離しないか?>>68

72 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/30 01:10:15
>70
MALDIじゃないっす。
SDS-PAGEからLC-MS/MSなんで質量分析から質量の情報はでないっす。
>69
そうですね。逆にそこが興味深いんですが。
細胞膜ではくっついてて、
異なるオルガネラではそれが乖離してるんですよ。
ただ結合がほどけない相互作用ってほんと、
どんなんでしょうね。
単純なダイマー化とかでもほぐれないことがあるとはしらなかったす。
ありがとうございます。
参考にさせていただきます。
あふぃにてぃーでもやるかな。

73 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/30 01:18:33
疎水性の高いタンパク質の場合、SDS dyeを入れてboilするとアグって泳動度が変わったりゲルに入らなくなったりするのがあるよ。
SDS dyeを入れたらboilしないで37℃でインキュベートすると改善することがある。

74 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/30 01:26:06
>71
ゲル中にウレアを混ぜるってことですか?
runningバッファーにまぜるってことですか?
>73
37℃オーバーナイトくらいっすかね。
膜タンパクやってるんでseparationゲルにひっかかるのが多くて困ってました。
興味深いです。
やってみます。

75 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/30 01:28:15
膜貫通領域を沢山持ったトランスポーターなんかでよくあるよ。
37℃ 15分か30分でやってる。

76 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/30 01:29:43
えっ!?
そんなに短いんですか?
逆に今までの泳動像がかわっちゃいそうですね?

77 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/30 01:33:23
さぁ・・・タンパク質によるだろうからね。
予想分子量に泳動されないときなんかには良く効くみたい。

78 :名無しゲノムのクローンさん:05/01/30 01:35:11
ですよね。
ターゲットがあるなら考えていいかもって感じですね。
ある程度網羅でやってるんで、
ひとつのツールとしてやるのが良いかなと思いました。

79 :名無しゲノムのクローン:05/02/01 19:17:58
質問させてください。
あるタンパク質をGSTフュージョンで発現させて、
GSTrap FFによるアフィニティクロマトグラフィーでの精製を試みてます。
このときに、目的のタンパク質だけが素通って、GSTと別々になって出てきたんですが、
原因などわかる方がいたら教えていただきたいです。
大腸菌は低張バッファーとリゾチームで処理した後、
1%CHAPSでタンパク質を可溶化しています。
色々試しましたが、もう万策尽きた感じです。どうか情報お願いします。

80 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/01 19:59:20

endogenousなプロテアーゼでGSTと目的タンパク質の間が切断されてんでないの?

目的タンパク質のN末を少し削ってpGEXのMCSに入れると改善する場合がある。

ヲレの場合、目的遺伝子の5'側にpBlueScript MCS由来の長めのリンカー
付で発現ベクターにしたら、ブチブチ切れたけど、ORFのATG近傍で詰めて繋げたら、改善して融合タンパク質が全長で発現するようになった。

81 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/02 00:23:11
>80
そうだったら、精製にプロテアーゼインヒビターとかいれとけば
改善するんじゃない?
GST

82 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/02 00:23:52
ゴメソ
末尾のGSTはけし忘れです

83 :電車漢:05/02/04 01:42:38
アンケート
よく使う発現ベクター教えてよ


84 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/04 09:00:46
pET 3a

85 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/05 14:15:53
pGEX4T-1

86 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/05 22:13:20
pGEX は 6P だな

87 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/06 14:00:59
pSEX69だな

88 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/06 16:22:12
>87
発現系作って論文書いたらその名前にするのね

89 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/06 16:47:21
つまらん

90 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/06 18:45:52
そんなもん3コスリ半で可能

91 :マ・クベ:05/02/07 10:24:19
やったー、結晶がでますた!!!!

92 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/07 23:31:15
塩ですた

93 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/08 05:15:26
酒石酸あたり

94 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/08 13:26:17
Mass Spectrometryでシークエンスしたいんですが、
Massのサンプルに塩、detergentなどが入っているとよくないそうなのです。
サンプルはやはり逆層クロマトなどをして塩を取り除いてからの方がいいですか?



95 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/08 22:04:25
まずはYESと言っておこう。

96 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/09 02:17:44
>94
金に余裕があるならZipTipを薦める

97 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/09 23:31:25
メーカー忘れたけどZipTipのぱくりでもっと安い
チップ型微量逆相がでてたとおもうぞ
フナコシかビーエムのカタログで見たような

98 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/10 00:38:28
初めて免疫沈降します。血漿をサンプルとしたいのですが、
この方法は一般的に、組織(細胞)に含まれている
抗原に対して行われているようです(?)、血漿は試料として用いられるものなのでしょうか?
宜しくお願いします。

99 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/10 15:30:22
血漿でも血清でも普通にできるよ
アルブミン・IgGなんかの割合が多いせいでバックグラウンドが
上がりやすいけど、血中に含まれるタンパクが欲しいんならやるしかないっしょ

100 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/10 16:34:46
脱塩(限界ろ過)で困ってます。アミコンやマイクロコンをつかっています。
タンパクが膜にくっつくためか脱塩時に半分以上ロスします。
何か良い方法はないでしょうか。
PD-10とかのほうが良いのでしょうかね・・

101 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/10 22:07:31
BSAでブロッキング

102 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/10 23:36:18
まあ言うとおり脱塩カラムのほうがいいでしょうな

個人的にはCentriPrepタイプの、膜内外の圧力差を利用したやつ
(液が内側で上がってくやつ)が好きだけど(別メーカーで小さいのがあったね)、
極微量だとそうもいかないか

103 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/11 10:21:15
ZipTip操作で空気を入れないようピペット出し入れというのがかなり面倒なんですが慣れるしかないですかね。
どこかに便利グッズってないものかしら。


104 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/15 10:33:42
>>101
精製してるのにBSAが混入するとまずくない?



105 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/16 00:12:58
サンプル中に尿素(7Mくらい)が入っていたら目的物がカラムに
吸着するのはまず無理でしょうか?イオン交換やアフィニティーを
考えているのですが。透析が大変なのでできるだけ省略したいのです。
疎水性相互作用ではどうでしょう?

106 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/16 00:17:06
疎水性とアフィニティーは無理。
イオン交換と、ひょっとしたらハイドロキシアパタイトは行ける
金属キレートもいける

107 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/19 04:42:38
非常にあぐる蛋白の精製で、タグアフィニティーの後に一発イオン交換かませてポリッシュしたいんだけど、1M NaCl入りのバッファーに使ってるサンプルをmonoQかmonoSでポリッシュできるっすか?
素人質問でスマソ。

108 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/19 22:33:54
>>64
SDS-PAGEはあくまで分子量で分けてるだけ。
大きさが同じ(に見える)蛋白質が2つ以上あっただけでは?
2DEで展開したら別れるのでは?

>>100
限外濾過のとき、溶液の回収は濃縮液を回収しているだけでは?
膜に吸着している部分も多いが、見えないくらいの液滴が集めれば結構な量で存在している。
適当なbufferで膜、容器を洗いこめば少なくとも半分しか回収されないということはないはず。
ぎりぎりまで濃縮→溶液回収→bufferで洗い込み→再度濃縮→溶液回収
の繰り返しで相当回収できるし、溶液量も大きくならない。

もともとの溶液量がわからんが、アマシャムのNAPシリーズで溶媒交換もありかと。
手間を惜しまなければ回収率はあまり気にしなくてすむ。(テクニックはいらんから)

109 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/23 02:07:17
はげしくあげええええええええええええええええ

110 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/23 12:28:44
>105
ハイアパならいける。
タンパクがCaサイトにつけば7Mの塩酸グアニジンでもいける。

111 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/23 18:25:59
生化学初心者です。
SDS-PAGEを行うために可溶化されたサンプル(SDS、BPB含む)は、
どのようにタンパク濃度を定量すればよいのでしょうか??
lowry法やBCA法のキットではBPBにより吸光度が読めないのでは
ないかと心配しています。
宜しくお願いします。

112 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/23 20:15:59
>>111
濃度既知のBSAと一緒に流してバンド強度を比較してみたら?

113 :111:05/02/23 21:02:04
>112 レスありがとうございます。

質問の仕方が悪くて申し訳ありません。
サンプルのアプライ量を検討するために、
流す前にタンパク濃度(μg/μl)を知りたいのです。

 

114 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/23 23:14:48
色素混ぜる前に測りゃ問題ないんだろうと思うけど
答えになってないんだろうなあ(レポートか?

紫外部とかはどう?試してみたら?

115 :111:05/02/24 00:16:56
しつこくて申し訳ありません・・・SDS-PAGE教科書に
「可溶化後、必要ならばアプライする前にタンパク定量し、至適な
量のタンパクを流す・・・」と
ありますが、私にとっては可溶化した時点で一般的にはBPBも入ると
思っているので、どのように定量しろというのかが分からないのです。
一般的に皆さんはどのようにSDS-PAGEをおこなっているのでしょうか?

116 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/24 00:29:35
なるほど。
ふつうはTBSみたいなマイルドな緩衝液に
溶かしている状態の試料のことを可溶化といいます。
TBS + 1%SDSでもよいです。
ですがSDSが入るとUVで定量はできません。

SDS存在下で蛋白質を定量するなら、Lowry法
とかMicroBCA法とか、蛋白質を発色させる試薬で
定量するのが一般的です。

ですが、>>112の方法の方が確実ですね。
つまりSDS-PAGEは二枚流すのです。
一つは分析用、一つはタンパク質の定量用。
慣れてくると分析用のPAGEの余ったレーンをつかって
定量ができるようになります。

117 :111:05/02/24 00:45:46
>116 ありがとうございます、大変参考になりました。
   2枚のゲルやってみます!

その方法に加えて、1×サンプルバッファー(without BPB)を
溶媒としてBCAで測りその後、2×サンプルバッファー(BPB含む)
で完全に可溶化→アプライしてみようかと今思いました。
(完全に可溶化できていなくても定量できるのか疑問ですが・・)


118 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/24 01:42:38
SDSやその他界面活性剤が入ってるとタンパク質定量が精確にできないことが
多いのでその辺調べるなり予備実験するなりしてやって下さいね。
この辺は常識と思いますが、、、

119 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/24 02:06:11
おすすめ本 protein labfax 手に入るといいのですけどね

120 :sage:05/02/24 04:04:00
>117

2MEが入ってたらBCA無理だったような…。2MEもぬいてね。
SDS Sample Bufferに溶かしたWhole Cell Lysateなんかは、
一度TCA沈殿して、BCAなりで定量。

121 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/24 16:04:58
>>111
そもそもプロセスが違うよ。
あるタンパク質サンプル溶液が先ずあって、タンパク質定量する。
次に、タンパク質濃度から計算してサンプルを極一部とり、
同量の2×サンプルバッファー混ぜる
→最終的に1×サンプルバッファー中にタンパク質サンプル。
というのが一番ベーシック。

サンプルが既にSDS, BPB, 2ME と混ざっている時点でタンパク定量を考えるな。

111の「可溶化」って言葉がみょ〜に引っかかるんだが、サンプルは何?
solubilize しなきゃいけないの?
lyse とか suspend って意味のような気がするんだけど。


122 :2ch:05/02/24 17:34:05
guest

123 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/25 12:33:59
疎水性カラムにタンパク質サンプルを吸着させましたが、100% B bufferでも溶出してこず、くっついたままみたいです。(Flow through, Wash, Eluteには出ていない)。
A buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.5, 1.2M (NH4)2SO4で吸着,B buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.5で、liner gradientをかけたあと100 %B bufferで流し続けました。
とりあえずはタンパクサンプルをカラムから回収したいのですがどうすればいいでしょうか?

124 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/25 13:51:44
50%エチレングリコール入りBバッファーを試してみそ。

125 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/25 16:04:47
SDS-PAGEのアプライ量はいつも勘だな
普通計算するもんなの?

126 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/25 16:24:36
>>125
目的によるでしょ

127 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/26 00:38:40
蛋白質を精製する際大腸菌での発現系として用いる場合、目的の蛋白質にシグナルペプチドや大腸菌の輸送系に認識されるようなペプチド領域を付けてやると目的の蛋白質が菌体外に分泌されて精製が簡便になるなどという方法はありますか?
もしくはKitとしてすでに発売されていますか?私は見たことありません(><)

128 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/26 00:42:09
人権擁護法=言葉狩り=2ちゃん書き込み規制

  Λ_Λ    / ̄ ̄ ̄ ̄ ̄ ̄ ̄ ̄ ̄ ̄
 <=( ´∀`) <  生粋の日本人である僕が人権擁護法で差別と叫ぶ。
 (    )  │ それで目障りな2ちゃんねらーの野郎を訴えて
 | | |  │ 裁判でぶっ飛ばしてやるニ・・・ぞ!
 〈_フ__フ  \__________

この法律には「差別的言動禁止規定」が含まれている。
外国人犯罪やハンナン食肉偽装事件を批判する正当な言論は2ちゃんねるにある。
これは、その2ちゃんの書き込みした人を次々に罰する法律だ。
在日外国人などがヒステリーを起こして「差別だ」として叫ぶと、
書き込んだ人をもう好き勝手に弾圧できるようになる。

第三条 何人も、他人に対し、次に掲げる行為その他の人権侵害をしてはならない。
  二  人種等の共通の属性を有する不特定多数の者に対して当該属性を理由として
前項第一号に規定する不当な差別的取扱いをする意思を広告、
掲示その他これらに類する方法で公然と表示する 行為
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
↑これ「2ちゃんねるでの在日外国人批判書き込み」という意味


 みんなの2chがカスどもに取り上げられようとしています。
 力を合わせて敵をやっつけよう みんなの力が必要です。
 お願いします。 頼みます。張ってください。
http://news19.2ch.net/test/read.cgi/newsplus/1109169724/l50


129 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/26 01:18:05
そういえば
なんかこれのコピペ見たな。
ずっと無視していたけどなんかヤバイ予感

130 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/26 02:48:31
>127

あるよ。
trxAタグで、雄もティック・ショックとか。
...原理不明...誰かフォローして。

ペリプラズム逝こうシグナルいくつかあるし、
ペリのタンパクも、浸透圧使って放出できる。
...trxAタグも、ペリに逝くのかなぁ...


131 :名無しタンパクのリコンビナントさん:05/02/26 16:22:56
>>127
大腸菌で菌外に放出される系はありません。
130さんのコメントの通り、ペリプラズムまで行くものは幾つかあります。
ノバジェンのカタログでも見て下さい。
また、酵母だったら細胞外に放出される系はあります。
インビトロジェンだったかな。


132 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/27 23:16:47
>>127
>>130
>>131
大腸菌で菌外に放出されると動作が保証されている
シグナルペプチドはありませんが、外来蛋白質を
たとえばアルカリホスファターゼなどのシグナルで
分泌されると3割くらいはペリプラでとまらないで
菌体外までいっちゃいましますよ
ペリプラで泊まってくれたほうが回収楽なんだけどなあ
2L限外濾過とか、うざくって ;_;
TRXはペリプラで泊まることが多いです
でも大きい蛋白は菌体内でとまっちゃいます

133 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/28 10:12:50
>>132
2L限外濾過はすごいね
塩析とか吸着濃縮でなんとかならないの?

134 :名無しゲノムのクローンさん:05/02/28 11:31:02
>>132
その分泌シグナルのシーケンスの情報(論文とか)を教えて頂けますか?
ペリプラの系の3倍強の培養をすれば目的量取れるのかな。

135 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/01 16:04:33
しりたい

136 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/01 16:32:05
この本ってどう?

新・タンパク質精製法 理論と実際
ロバート K.スコープス/著 塚田欣司/訳
シュプリンガー・フェアラーク東京

値段が4791円で手ごろで読みやすい感じなんだけど


137 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/02 01:31:57
ピアス社の免疫沈降キットについて、使用後の泳動バンドは
抗体と目的のタンパクとが架橋されたものとして検出されるの
でしょうか(抗体のぶん高分子量のバンドがでる?)?

138 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/02 01:57:01
>>134
さがすとそれなりに論文はあるけど
このへんでどうよ?
ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=11922762
ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=8206380

139 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/03 02:59:11
精製する目的タンパク質がプロテアソームのターゲットの場合、インヒビターを
バッファーに加える以外に何か良い方法は無いでしょうか?プロテアソーム阻害剤は
非常に高価なので代案があれば本当に助かります。

140 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/03 10:23:10
>>139
指キチン科されてるの?
だと、EDTAでいいような気が…

141 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/03 11:52:04
>>136
昔、読破したことがある。
いい本だと思うよ。
カラムの原理とか知りたければ、ファルマシアにカタログもらえ。
あれはいい本だった。

142 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/03 12:49:59
>>141
ファルマシア(今アマシャムか)のカタログ昔はただだったみたい
だけどいま有料だよ

143 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/03 13:30:47
>>140
指キチン蚊されてるかどうかは分からないですが、4℃で透析中にも分解を受け困ってます。
EDTAはプロテアソーム活性測定キットにも含まれていると思うのですが、効果あるでしょうか?

144 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/03 15:20:50
>>143
指キチン系は4℃では働かないから、指キチン分解とは違うんじゃない?
ただのプロテアーゼ分解では?

145 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/04 01:08:31
なんかフッ素の化合物でATPaseの阻害剤なかったっけ?
それいれたらプロテアソーム系とまるんじゃなかったっけ?

146 :139:05/03/04 03:05:39
返答ありがとうございます。
プロテアーゼ分解も疑ってみます。現在はシグマのProtease Inhibitor Cocktailを
使用していますが、さらに検討してみます。
ただ、in vitroではプロテアソーム阻害剤であるMG115やMG132で目的タンパク質
の分解は抑制されるので、湯引きチン系でないかと考えていました。
フッ素化合物についても調べてみます。

147 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/07 00:23:46
>>145
pervanadateのことかな?

148 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/07 22:03:56
SDS-PAGEでバンドが予想よりも大きく出てしまいました。
ゲルろ過から推測すると予想の位置にピークが現れるので
タンパク自体がおかしいとは思わないんですが、
SDS-PAGEで大体の分子量が会わないとめんどくさいなーと思いまして。
どうにかなる方法をしりませんか?
というより、どうしてこうなるんでしょう?

149 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/07 22:11:17
よくあることだ。いちいち文句を言う奴もいない。


150 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/07 23:52:36
フォトショで改竄しろよ

151 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/10 06:23:12
組織から分子量50KDa程度の転写因子を抽出するつもりです。
過去の文献ではsample bufferのbaseがHEPESとTrisの2種類あるのですが、
違いはなんなのでしょうか?
あと、ついでなのですが・NP-40, triton-X, SDSの違いについてもお願いします。


152 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/10 07:12:02
>>148
タンパクの塩基性が強い場合、
SDS−PAGEで流れにくくなることがある。
つまり、分子量が大きい目にでることがあるってこと。

153 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/10 07:19:05
>152 どういう理由? リン酸化修飾のように
酸性タンパクの移動が遅くなるのはわかるんだが。

154 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/10 09:24:13
リン酸化でバンドがシフトするのは酸性だからじゃないだろ

155 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/11 09:21:18
>>151
HEPESとTris、違いはないような…。
培養細胞とかに、HEPESがよく使われる
印象が個人的にある…。

NP-40とTritonは非イオン性のdetergent。
SDSはタンパクの構造壊したりしますが、非イオン性はマイルド。
NP-40よりTritonX100の方が少し強い
印象が個人的にある…。

156 :151:05/03/11 12:39:44
>>155
わーい、レスどうもありがとうございます。
Trisを使う理由はpHの安定度(>PBS)を求めていると思うのですが、
HEPESにも何かメリットがあるんでしょうか?
でも、Trisと差が無いなら、慣れているのでTrisを使います。

あと、Westernで予定と異なる位置(高分子の方)にバンドが見えます。
現在のtriton(0.5%)⇒SDS(1-2%程度?)に変えると分子が予定の位置に移行する可能性ってありますか?
それとdetergent濃度を高くした場合、どういう変化が実感できますか?
感覚的な話で構わないので参考にさせて下さい。

今までがRNA主体の実験で、コンタミだけ気をつけていれば結構簡単に行ったんですが、
どうもタンパク実験は経験が少ないことが原因で、その調整の機微が良くわかりません。
インターネットでもそういう感覚的なことは余り書かれてないんですよね。
(そんなのばっかり書かれても困るんですが・・)


157 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/11 21:43:58
>151
あんまり詳しくないですが、Trisは温度変化によってpHが変わり
やすいからじゃないの?Hepesはそんなことないと思う。Hepesの方が
その分高いけど。あとTrisには細胞毒性があると言われている。

158 :151:05/03/14 13:04:21
Thanks

159 :ンク:05/03/17 15:07:15
>120
私は2MEやDTTはICH2CONH2でつぶしてから問題なくBCA定量してます。
96穴プレート中50mM ICH2CONH2 10-30 microLにサンプル2uL加え、
37Cで30-60分処理後、BCA溶液を加えてBSAとサンプルバッファー対照で測定します。
えらい遅いレスですみません。

160 :sage:05/03/19 12:15:30
アマシャムのGSTを切るprescission proteaseって推奨切断条件のNaCl濃度150mMなんだが、
もっと濃度あげても(0.5-1Mくらいに)切れるか知っている人います?
intactのサンプルの可溶化に塩濃度必要なので、、、。

161 :名無しゲノムのクローンさん:05/03/19 13:45:06
切れるんじゃねーの?

っていうか、そんなの人に聞く時間があったら、
実験したほーが早い。

162 :名無しゲノムのクローンさん:2005/03/24(木) 23:18:44
酵母から組み換えタンパクを精製するときってプロテアーゼ阻害剤は何を使えば
いいですか?とりあえずPMSFはいれてますが。

163 :名無しゲノムのクローンさん:2005/03/25(金) 00:34:37
EDTAとかもどうぞ。
市販の阻害剤セットもあるよ。

164 :名無しゲノムのクローンさん:2005/03/25(金) 22:42:32
ささいな質問ですが。
数mlの吸着系のオープンカラムにサンプルをかけるとき、
連続してサンプルを流していくのと、1カラムボリュームずつ流して
いくのでは吸着効率に差がでますか?
溶出バッファーを流すときでは流し方で溶出効率に差が出るというのを
きいたことがあります。

165 :名無しゲノムのクローンさん:2005/03/25(金) 22:46:12
気にせずガンガン流してる。
どうせリコンビナントだし(自虐)

166 :名無しゲノムのクローンさん:2005/03/26(土) 11:18:09
気にせずに流しているがめちゃめちゃゆっくり流すよう
こころがけている
いわゆるDEAD-SLOWちゅうやつ

167 :名無しゲノムのクローンさん:2005/03/26(土) 13:34:36
昔いたプロテイオス信者はまだ元気かな?

168 :名無しゲノムのクローンさん:2005/03/26(土) 15:04:42
透析以外のバッファー交換の方法でいい方法ありませんか?
液量が多いときに使いたいのです。

169 :名無しゲノムのクローンさん:2005/03/27(日) 13:10:38
>168
大規模限外ろ過
遠心機でスピンダウンするようなのはダメね

170 :名無しゲノムのクローンさん:2005/03/29(火) 00:15:20
低温室でクロマトするのと室温でクロマトするのでは
流速とタンパク質の分解以外でどこが違ってきますか?

171 :名無しゲノムのクローンさん:2005/03/29(火) 00:51:26
>168
バッチ法で イオン交換
もしくはブチルトヨパールとか
1リットルくらいだったらイオン交換でもいけるよ

172 :名無しゲノムのクローンさん:2005/03/29(火) 22:13:04
カラムってどこのメーカーのがいいんですか?
まあ安いのが一番なんですが

173 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/02(土) 12:06:45
タンパクを抽出する時に、抽出bufferに入れるタンパク質分解酵素阻害剤ってみなさんは何を使ってますか?
私はpefablockを使おうと思っているのですが、これは何mM入れればよいのでしょう?

174 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/02(土) 12:32:39
>>168

サンプル容量の4-5倍の容積のゲル濾過カラムなら脱塩は問題ない。

175 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/02(土) 13:04:43
>>168
>>174
直径5cmx1m位の巨大脱塩カラムを使っている人たまにいるよね。
直径10cm超の大物はまだ見たことないけど。

176 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/03(日) 00:03:15
大容量脱塩なら透析か限外ろ過がいいとおもうよ
塩析したあと疎水クロマトも考えたほうがよい

177 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/03(日) 00:09:40
透析はサンプルが多いときはさらに大量のバッファーが
必要だから厳しいかと。

178 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/05(火) 02:01:27
容量が大きいのに、ゲル濾過や透析なんて問題外!
限外ろ過は収量悪いし、共存物ですぐ詰まし、大容量にはとても使えない。

やすっちい疎水カラムを、疎水性が弱い順にタンデムにつないでみぃ!
スモールスケールになるし、精製も進むし、脱塩もできるはずだ。

と、何の塩なのか、塩濃度もvolumeも共存物の量・質も目的物の等電点も疎水性も知らずに言ってみよう。
(この辺がわかれば次の手が浮かぶはずだ)

179 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/13(水) 10:17:46
タンパク質をメンブレンにドットプロットして抗体で検出したいのですが,
どなたか良い方法をご存じないでしょうか?

スクリーニングに用いるので,サンプルはwhole cellを溶解したものになります。


180 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/13(水) 10:29:53
何が聞きたいのかわからん。
「良い方法」って何と比較してだよ。
人に聞く前にまず自分で調べて手を動かせやヴォケ。

181 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/13(水) 13:32:20
>>179
Dot-ELISAだろうな。

182 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/13(水) 16:56:47
>179
十分良い方法だと思います どんどんやりなさい

183 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/14(木) 01:15:35
>179
タンパク質をメンブレンにドットプロットして抗体で検出って、自分で方法書いてんじゃん。
がんがんやりなさい

184 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/14(木) 08:24:15
>>181-183
どうもです。

説明が全然足りませんでしたねorz
お聞きしたかった事は,サンプルの調整法です。
whole cellを使うので何らかの方法で,細胞を破壊しなくてはなりません。
手に入ったdot blotのプロトコルは全部,精製したタンパクを使うもので,
果たしてSDSやTritonX100を使ったlysateをそのまま使えるのだろうか?
という疑問があったのです。

今日 whole cellを1)SDS bufferでlyse 2) 1% TritonX100でlyse
3)懸濁液をFreeze/Thawして遠心した上澄みでdot blotをしてみたのですが
3)だけがポジティブでした。
お騒がせしました〜

もりもりやっていきます

185 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/14(木) 22:57:44
sonicやフレンチプレスでやったらどう?

186 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/17(日) 21:19:37
>>184
PVDF膜?疎水結合で結合してるから界面活性剤入りだと
タンパク質落ちてると思う。だから3)だけがpositiveだったのでは?

187 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/18(月) 00:05:02
アマシャムのHitrap NHS-activated を使用していた方はいらっしゃいますか?
抗体をカップリングしようとしているのですがうまく行きません。
コツがあれば教えていただけないでしょうか?
カップリングバッファーのpHは7.5のものを使っています。
よろしくお願いします。

188 :sage:2005/04/25(月) 00:11:15
既製品としてはどこのメーカーも扱っていない放射性同位体低分子化合物はどこか受注生産してくれるものなのでしょうか?

189 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/25(月) 11:41:14
>188
セティ あたってみな

190 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/26(火) 01:09:31
バッファー成分をリン酸Bにしてみそ
>>187

191 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/28(木) 16:23:07
>>190
プロトコルに従って炭酸Bを使っておりました。
試してみますね。ありがとうございます。^^

192 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/28(木) 19:57:48
His-TagタンパクがどうしてもNi-NTAにくっついてくれず、FTに出てしまいます。どうしてでしょうか?また、どうしたらいいでしょうか?

193 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/28(木) 21:51:42
>>192
ディネーチャーさせる。
シーケンスを読む。
場所を変える。
俺はプライマー設計間違えて
C末にプロリンタグができてしまったけど、
なぜか収量悪いながらも精製できてしまった・・・

194 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/28(木) 22:02:52
俺の玉は毎日作ってる

195 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/29(金) 11:58:10
>193
Natureの状態で取りたいんですが・・・・・。

196 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/29(金) 12:07:00
Natureの状態?

197 :名無しゲノムのクローンさん:2005/04/29(金) 13:22:44
>>192
タグがタンパクの内部に隠れとるんでないの。
193の言うように場所変えろ。
タグは目印と割り切って普通に精製するのもあり。

198 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/11(水) 10:09:14
GST融合蛋白質の特徴と長所、短所
アフィニティークロマトグラフィーの特徴
ミクロソーム画分に糖蛋白質が濃縮される理由

教えてください。

199 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/11(水) 10:21:19
宿題は自分でやれ

200 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/11(水) 18:57:03
タンパク発現時のairationってそんなに大事?羽付使ったらうまくいってどんぐらい発現量アップするんかいね?

201 :sage:2005/05/13(金) 00:30:03
よく先生達が言ってるんですが、『ひとくい』ってどういうことなんですか?
なんだかいまいちわからずにいます。

202 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/13(金) 00:41:00
人間を食糧とするってことだよ。人類最大のタブーだ。

203 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/13(金) 00:46:51
>>201
なんでその先生達に尋ねないんだね?
聞くは一時の恥、聞かぬは一生の恥、ですよ。

204 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/13(金) 01:09:08
そこで人肉食学専攻の漏れ様の登場ですよ

205 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/13(金) 07:10:03
人喰い、非特異、火得意、日と杭

206 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/13(金) 17:12:08
>>192
>> His-TagタンパクがどうしてもNi-NTAにくっついてくれず、FTに出てしまいます。どうしてでしょうか?また、どうしたらいいでしょうか?
(1)His-tagがついているかどうかを確認する。
   変成状態でNi-NTAにかける 又は、Hisタグの抗体でWestern
(2)ついていなかったら、プロセッシングを受けている可能性が高いので、場所を変える。
(3)ついていたら、構造的にリガンドに相互作用しにくい場所にあるわけだから、
   リンカーをのばしたり、N末、C末を代えたりする。あるいは、薄い濃度の
   変成剤を使用してもよい(条件検討が難しい)。

207 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/14(土) 21:38:42
>>201
『ノンスペ』ってことだよ

208 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/16(月) 12:55:42
案外、流速が早いとかイミダゾールの入れすぎってことはない?
ポンプは使っていますか?

209 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/17(火) 00:54:12
タンパク質精製の方法をご教授お願い致します。
概要でいいのでお願い致します。
私は頭の悪い高卒です。すみません(>_<)


210 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/17(火) 13:06:44
>206
どうしても変成させないで取りたいのですが、Lysis buffer のpHをかえる、またはImidazoleの濃度を変える。
4℃で吸着させているのを、室温にしてみる。
吸着時間をオーバーナイトにする。

こういったことは効果があるのでしょうか?

211 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/17(火) 18:00:45
>>210
横槍ですまぬが、変性条件で取れないものを非変性条件で取れるはずがないと
206は言っているのだよ。206が言ったことを試しましたか?
その報告をしない限り206からレスは来ないと思われるよ。

212 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/17(火) 18:08:23
>>209
いろいろあるからなあ。
概要だったら

クロマトに掛けて分画を取る

って感じ?

213 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/17(火) 18:32:17
すいません、質問させてください。。
塩基性蛋白質をnative-PAGEで分離する場合、Buffer組成はどのようにすればいいのでしょうか??
できれば濃縮ゲルと分離ゲルの二層系で行いたいのですが。。

そのまま電極だけひっくり返せば??でもそれだと濃縮ができないですよね。。
分離ゲルのpHをあげて、電極はそのままで流せばいいのでしょうか。。??

214 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/17(火) 18:43:39
等電点にするかアフィニティつかえば?

215 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/17(火) 20:35:52
>211
すいません。
変成条件では取れました。Westernで確認済み。

216 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/20(金) 15:06:38
抗体作成の際の質問です。
ある蛋白質をHisタグで精製して
500mMimidazole/PBSで溶出しようとしています。
このときこの溶出物をそのままウサギなどに免疫して大丈夫でしょうか
本当は透析したほうが良いのでしょうが、、。

217 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/20(金) 15:57:09
age

218 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/21(土) 02:09:17
>216
うちは250mMまでならOKってことで、PBSで希釈して打ってるよ。

219 :216:2005/05/22(日) 12:12:17
>>218
どうもありがとうございます.
ググって調べると
http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;Code=951
のようにureaとか、sdsの情報はあるのですが、、imidazoleに関してはそういう情報無かったので
当方も希釈して打ってみます。

220 :名無しゲノムのクローンさん :2005/05/27(金) 23:19:10
pGEX-2TとBL-21用いて、GSTタグをつけたタンパクを発現させています。
インダクションをしたサンプルを、ウエスタンして、抗GST抗体を用いて染めてみたところ、
予想される泳動位置付近の前後10〜15kDaに複数の強いシグナルのバンドがでました。
これらのバンドはIPTGによりインダクションされているようで、カラムで精製しても残ります。
シングルバンドにならないのは、何が原因なのでしょうか?
どなたか教えてください。



221 :名無しゲノムのクローンさん:2005/05/30(月) 10:56:00
予想されるものより上のバンド・・・・シャペロンタンパク質?
予想されるものより下のバンド・・・・モノの分解物?

222 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/07(火) 00:47:11
保守上げ

223 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/07(火) 00:48:44
あがってないやんw

224 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/07(火) 14:14:32
>>220 大きいほうのは、サイズによっては>>221の言うとおり
GroEL(57kDくらい)がへばりついてる可能性がある。市販のGroESまぜて消えるかもよ。
小さいほうは、これまた>>221言うとおり分解物の可能性が1つ。
低温キープとプロテアーゼインヒビターに気を遣って、量が変わるか見てみると良い。
あと、N末に近い位置にMetがあるときなどに
本来の開始コドンのMetでなくそこから転写がはじまってしまうことがある。
pGEX-2TってN末にGSTだったっけか?ならその可能性はないか。

漏れも修士の頃にGSTフュージョンで苦労して、
組み換えタンパクそのものは実験につかえんかったけど抗原として使って、
できあがった抗体がやけに性能よかったことがあるなぁ。なつかしい。
>>220がんばれ。

225 :220:2005/06/08(水) 23:59:05
>>221
>>224
レスありがとうございます。

>>組み換えタンパクそのものは実験につかえんかったけど抗原として使って、
できあがった抗体がやけに性能よかったことがあるなぁ。

発現させたタンパクは抗原として用いる予定なので、希望が見えてきました。
ウサギさんには申し訳ないけど、近いうちに注射して見たいと思います。
何としても免疫染色まで進みたいっす。


226 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/09(木) 10:10:35
O.D.が1を上回っててもタンパク発現ちまつか?

227 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/22(水) 04:04:55
microheterogeneityっぽいのに当たりました。
まだ理由は分かっていません。
・リン酸化の(程度の)違い
・N-末端不揃い
・糖鎖
などが考えられると思うのですが、それぞれ分離する方法ってあるでしょうか?

228 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/29(水) 15:48:46
質問です!
Lysis bufferってなんでもいいの?どんな種類があるの?

229 :名無しゲノムのクローンさん:2005/06/30(木) 00:54:48
福沢諭吉 「脱亜論」(明治18年)

 日本の不幸は中国と朝鮮だ。
この二国の人々も日本人と同じく漢字文化圏に属し、同じ古典を共有しているが、
もともと人種的に異なるのか、教育に差があるのか、 日本との精神的隔たりはあまりにも大きい。
情報がこれほど早く行き来する時代にあって、近代文明や国際法について知りながら、
過去に拘り続ける中国・朝鮮の精神は千年前と違わない。
国際的な紛争の場面でも「悪いのはお前の方だ」と開き直って恥じることもない。
もはや、この二国が国際的な常識を身につけることを期待してはならない。

「東アジア共同体」の一員として その繁栄に与ってくれるなどという幻想は捨てるべきである。
日本は、大陸や半島との関係を絶ち、 欧米と共に進まなければならない。
ただ隣国だからという理由だけで特別な感情を持って接してはならない。
この二国に対しても、国際的な常識に従い、国際法に則って接すればよい。
悪友の悪事を見逃す者は、共に悪名を逃れ得ない。
私は気持ちにおいては「東アジア」の悪友と絶交するものである。

原文
http://www.chukai.ne.jp/~masago/datuaron.html

230 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/01(金) 03:37:07
たんぱく質の発現につまづいて困っているんですが・・・

あるたんぱく質(約130kDa)をpET28aに組み込んでBL-21で発現→HisTag精製
したいのですが、目的のたんぱく質が発現しません。
条件を色々試したのですが同様に発現はされてませんでした(発現温度を低く設定、
IPTG濃度、低温精製など・・・)。
ちなみにこのたんぱく質自体は酵素活性を持っていることは分かっているので大腸
菌に対して毒性を持っている可能性があるのかもしれません・・・・
なんとか大腸菌で大量に発現させたいのでが・・・

どなたかこういった状況に陥った人がいれば打開策を教えて下さいm(__)m
よろしくお願いします。

231 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/01(金) 09:48:53
>>230
ホストがBL21では永遠に無理


232 :ゆきだるま:2005/07/01(金) 10:31:34
私も230さんと同じような状態で困ってます
231さん何故ですか?

233 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/01(金) 10:56:39
BL21DE3でないといかんな。
あとBL21DE3Lysにしておけ、リゾチームは低レベルで発現しているT7RNAポリメラーゼの
活性を抑えるのでIPTG添加前の目的単膜質のリーキーな発現を抑制する。



234 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/01(金) 20:28:04
>>231, 233
あっ、すみません。言葉足らずでした
BL21(DE3)とBL21(DE3)pLysSを両方使ってだめでしたorz
コドンが合っていることも確認はしたのですが・・・・

大腸菌系ではダメなたんぱく質とかなんでしょうか・・・分からんorz

GloESなんかを共発現させるベクターとかを使ったら大丈夫ですかね?

235 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/02(土) 08:23:15
バキュロかピチアでやれ

236 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/02(土) 09:04:08
>>234
沈殿画分にも発現がまったく(毛ほども)見られない?
His-TagまたはT7-tag(もしついていれば)に対して
のウェスタンでも確認できない?
インダクションのタイミングをかえてみた?

237 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/02(土) 11:36:41
>>230
大きいタンパク質だね。

>発現温度を低く設定、
インダクション後に温度を下げるのは可溶化のため(インクルージョンボディーに行かないようにするため)だ。
低温だと発現のスピードが遅くなるだろ。
発現しないときに温度を下げては逆効果だろう。

>IPTG濃度
効果がある場合も、ない場合もある。らしい。

>低温精製など・・・
本当に発現していないのだったら、精製も何もあったもんじゃないだろう。

>菌に対して毒性を持っている可能性
毒性があったら、すぐにわかるよ。

>pLysS
あんさんの場合は、やめた方がよいナ。


あんさんの言ってるのは、クマシーでバンドが見えんってことだろ。
>>236さんも書いてるけど、ウエスタンか何かで確認してみ。
ウエスタンでも見えなかったら、、、

238 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/02(土) 12:23:52
分解が早いタンパク質をHisタグで精製したときは、2mM IPTGで30分誘導してただちに
遠心回収、液体窒素、それからグアニジン塩酸入りlysis bufferで壊して
遠心、上清をNiカラムで回収した。その後、SDS-PAGEで切り出し精製。
1000ml培養して最終標品0.1mgぐらいしか回収できなかったが抗原としては十分だった。

E.coli細胞内で分解が早いタンパク質はけっこう多い。

239 :名無しゲノムのクローンさん :2005/07/02(土) 14:33:24
単純に発現量を上げるのなら、MMIやH15を使うのが私は好きだ。可溶化条件はその後だからね。

240 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/02(土) 15:05:00
>>239
くわしく!

241 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/02(土) 16:59:23
>>230
もし毒性が原因なら活性中心を潰した変異体なら出てくるハズ。

242 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/03(日) 01:29:09
BL21DE3 の代わりにOrigami2DE3に変えてみたら 結構いいかもよ
培地や温度条件も結構効く

243 :234:2005/07/03(日) 02:41:06
>>235-242
アドバイスありがとうございます。

ウェスタンではなくて銀染色で一度染めてみることにします。
(ウェスタンに使う抗体がないもので・・・orz)
ところで、クマシーで染まらないたんぱくとかってあるのですか?
今までクマシーで染まらないとかなかったもので・・・・

>>237さん
素人質問ですが、毒性が原因ならすぐに分かるというのは
クローニングしたときにコロニーすら生えないということでしょうか?

なんか知らないことばっか出てきた。。。orz

244 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/03(日) 16:41:18
ある程度タンパクの量が多くないとクマシーでは染まらない

245 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/03(日) 19:04:56
糖鎖がめちゃんこ付いたタンパク質はCBBで染まりにくいかもしらん。

246 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/03(日) 22:46:09
大腸菌使っているって書いてんだから糖鎖修飾は考えない方がいいんじゃね?

247 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/03(日) 22:55:57
>>242
オリガミってなんか生育遅いし蛋白発現量もすくなくない?
俺的には最後の手段のさらにさいごのほう

248 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/04(月) 13:38:31
234 から >>230>>234>>243 へ。

1)「クマシーでバンドが見えん」ってことはタンパク質が「クマシーで染まらない」ってことぢゃなくて、
目的のタンパク質の発現がバクテリアのタンパク質と同じ程度かそれ以下しかなく、
誘導前と誘導後のSDS-PAGEのクマシー染色像をみても、本当に発現しているかどうかがわからないこと。
だから、銀染しても無意味。
ウエスタンかなにかで特異的に見分けなきゃ。

普通だったらブッ太いバンドになるだろうが、タンパク質によっては微量にしか発現しない場合もあるヨン。

2)毒性について。
クローニング中はタンパク質が発現してないから毒性はないだろう。
本当に毒性があれば、誘導をかけた途端にバクテリアの増殖が止まるか、死ぬよ。
これは本当にすぐにわかる。

ちなみにオレはpLysSなんか使わなくてもリーキーな発現を経験したことがない。




249 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/11(月) 22:21:14
大腸菌株でタンパク質発現→破砕→グルタチオンアフィニティクロマトグラフィ
までの実験をやっているのですが
精製サンプルをSDSーPAGEで流してみると
精製サンプルがデグってしょうがありません
問題はいろいろあるんですがまず初めに
精製前のサンプルから既に分解が起こってるようなのですが
先達が成功しているプロトコール通りの吸光度・培養時間も守り
温度が原因かと18℃あたりで長時間振ってみてもうまくいきません
目的タンパクが発現〜ハーベストまでに分解してるなら
インダクションに問題があると思うのですが
なにかアドバイスあったらお願いします

250 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/11(月) 22:42:57
>>249
破菌までに問題があるかどうかはタイムコースをとって目的たんぱくが分解されているのか
どうかを見るヨロシ
破砕した後のバッファーにインヒビター入れてるんですかい?
入れてないなら入れるヨロシ
あと、低温精製は厳密にね

251 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/12(火) 12:25:16
タグをGSTからマルトース結合タンパク質に変えただけで、degradationも無く
単一バンドになった例もあるから、Hisタグ、MBPタグ、チオレドキシンとかいろいろトライしたら?
カルモジュリンカラムで精製する方法とか。

252 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/13(水) 00:50:18
いきなりですみませんが、ウサギから得た抗体を抗原を使って精製した後に、
免疫沈降を行いたいと思っているのですが、評判のいいキット類ってありますか?

253 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/13(水) 01:57:19
>247
origami2(DE3)はkan感受性になり 異様に生育が早い
タンパク発現も良好 rosetta-gami2は遅い 発現量も少なめ

254 :249:2005/07/13(水) 02:17:50
>>250
>>251
ありがとうございます 参考にします

255 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/13(水) 23:36:54
247
>>253
情報サンクス この業界日進月歩だから楽しいな。試してみるよ。

256 :退役水兵:2005/07/14(木) 20:40:08
>254

同じ抗体でIP&Westernをしたいと解釈して良いのか?

策1. 普通にIP。で、Westernの一次抗体は予めビオチンでラベルしておく(易)
策2. 抗体カラムをつくる。(ちょっとマンドクセ)ピアスのSEIZE Xとかのキットだ。
ww.funakoshi.co.jp/h_news/0506/050627_PCCs.php
抗体の配向性を保持しつつ固相化できるのがウリだが、自作も可能だ。
ちなみにDSSは-NH末端やKなどのアミノ基と結合するから、
抗体によっては結合が無くなったりするから、
そんときは板の住人に聞いてみると良いだろう。


257 :?256???:2005/07/14(木) 20:46:56
すまん、まちがえた
>>252
だった。

258 :学生:2005/07/15(金) 13:04:44
すいません板違いかとは思いますが…

おまいらGFPの発色機構教えてもらえませんかm(__)mどうしてもわからないんです。。

259 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/15(金) 13:24:10
さげ

260 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/15(金) 17:01:36
>>258
クロンテックのマニュアル落として嫁。

261 :252:2005/07/15(金) 23:23:48
>256
ありがとうございました。今から実験やるので参考にします!

262 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/18(月) 22:35:01
精製ではなく除タンパクの質問です。
申し訳ないが、教えてください。

糖の入った水溶液をHPLCで測定するのですが、教授から前処理は
スルホサリチル酸を加えて除タンパクをしろといわれました。
このスルホサリチル酸とは、硫安のような化学的作用があるのでしょうか?
初めて使う試薬なので、よく分からないのです。。。
教えてください。

263 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/18(月) 22:43:43
まずは教授に聞けよ

264 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/19(火) 02:14:56
>>262
除タンパク処理にはそのほかに
TCA沈殿という方法とフェノール処理という方法が一般的です。
スルホサリチル酸はこの二つをあわせたような感じとかんがえれば
よいと思います。

265 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/22(金) 18:41:28
Hisタグ蛋白質の精製についての質問です。
Niアフィニティーゲル(レジン)を用いて目的タンパクを
回収して、イミダゾールで溶出した後、イミダゾールを除去したいのですが、
安価な除去カラム、もしくは別にお勧めの方法があれば教えてください。

266 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/22(金) 22:45:08
>>265
http://www.jp.amershambiosciences.com/catalog/web_catalog.asp?frame5_Value=61
俺はこれ使ってる。楽に脱塩できるよ。

267 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/23(土) 00:17:55
>>265
濃縮カラムで濃縮→フローを捨てて欲しいbuffer加えて再び濃縮→濃縮+脱塩できてる。(°Д°)ウマァ

268 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/23(土) 00:37:57
HiTrapは液量が多い場合濃縮しなきゃいかんけど
比べたら透析よりも便利だなあ

269 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/23(土) 01:22:12
今ってリフォールディング以外で透析することって珍しくないかい?

濃縮だって7mLとかを一回でやれるカラム発売されてるし

270 :退役水兵:2005/07/23(土) 09:58:46
>269
確かにそうかもしれん。昔は100 mL程度のサンプルを透析膜で
脱塩/緩衝液の置換、さらには濃縮も透析膜一本でやっていたんだが。
つい一ヶ月前に透析膜をウチのラボで頼んだんだが、業者に珍しがられたわい。
「いやぁ。まだ使っているセンセェいるんですねぇ」と。

271 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/23(土) 10:01:55
DNAの切り出し精製を透析チューブでやってますが何か?

272 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/23(土) 23:14:26
>>267
濃縮カラムにAmiconの限外濾過カラムはいけますか?


273 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/24(日) 10:18:31
>>272
タンパクが捕まるんなら大丈夫。GO!!

274 :('A`):2005/07/24(日) 10:23:07
>>270
しかし透析はいろんな技術を加えると使える技術であることは確かなんですよねぇ。
最近じゃヌクレオソーム再構成とかを透析使ってやってたりするし。

今じゃ、もしかするとウレア使ってのリフォールディング法なんて知らない学生がいるやもしれんなぁ。。。

275 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/24(日) 17:16:44
>>273
ありがとう!検討してみます。

276 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/24(日) 20:53:27
>>264
遅レスですが、ありがとうございます。
TCA+フェノールみたいな感じなのですか。

277 :退役水兵???:2005/07/26(火) 22:51:15
>>274
それはどうだろう?
大腸菌発現系で封入体確定したタンパク質の精製だったら、
学生さんでも知っているんじゃないかな?

ウチでは封入体タンパク質のリフォールディングは
ArgやGSH/GSSG、PEG、Ureaなどを用いた緩衝液を数種類準備して
Rapid dilutionで条件を検討してるよ。
アフォかヴァカかと思うかもしれんが、活性を保ちつつ消耗作業を避けて
モノを多くとる為には条件検討は避けられないからね。

278 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/27(水) 00:29:27
シクロデキストリンとか使ったことある人いる?


279 :退役水兵:2005/07/27(水) 08:33:39
>>278
Cyclodextrinのう。
こいつはタンパク質表面にくっついているGuHClやSDSを奪うんだっけ?
疎水性相互作用に関連するとBBRCのレポを読んで、条件検討のとき
5mMの濃度で単独および0.5M Argに対する併用効果を見たが、
効果はDextrin < Arg ≦ Arg+Dexだったな。
まぁ、CHCl3で夾雑物排除後にGu-HClで溶かしてBradfordで蛋白定量と
SDS-PAGE展開して見た程度だから少々の誤差はあるが。

280 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/28(木) 00:16:49
タンパクを1mMIPTGで誘導→6時間培養したヤツをSDSでやったんですけど、
バンドがあるにはあるが、発現量異様に少ないんですけど・・・・思い切り大量培養→回収がんばる!!
しかないですかね?


何か良い打開策あったら教えてください。お願いします。

281 :????:2005/07/28(木) 08:01:41
基礎的な逆質問。
6時間の誘導は適切なの?温度は?
タイムコースをとった上で6時間培養が適切だったのならば仕方ないよね。
培地組成を変更して菌体数を稼ぐか、大量培養でGoするくらいしか策はないよねぇ。
たしか、類似の内容がこの板の過去で議論されてた筈。

こちらはpETマニュアルに書いてある通りの方法(1 mM IPTG、37℃で1-1.5時間の誘導)
でしっかり発現タンパク質が確認出来たよ。
といっても、5 mm幅のレーンで1 mm程度の太さしか無かったけどね(しかも薄い)。
でも、SDS-PAGEではしょぼしょぼのバンドだったのが、同じサンプル量を
アプライしたWesternではバンドモッコリ&誘導前後の差異が確認できて勘当しますた。

282 :超初心者:2005/07/28(木) 15:57:00
262に続いて除タンパクについての質問なんですが
こちらは過塩素酸で行うということになりました。

サンプルの血液が非常に微量で中和の判定方法が難しいのではないか。
はて、どの割合で過塩素酸を加えればいいんんだろう。

本を探しても載ってないなぁ、というとこなのですが、これは少しづつ加えるしか
ないですか?


283 :退役水兵:2005/07/29(金) 08:00:51
>>282
割合について。
タンパクのサンプル1/10量の70%過塩素酸を加えてMix、遠心を10-15分。
DNAのフェノクロのような感覚で行えば良いでしょう。

詳細は指導教官に仰ぐと良いと思いますが、「ソースは2ちゃんで…」というと
小一時間rw)なことになるかもしれませんので.
Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention Vol. 8, 507-512
マテメソの組織からの蛋白と核酸抽出方法をソースにあげればよいでしょう。
では良い一日を。

284 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/29(金) 22:23:18
たんぱく質の精製に関して質問( ノ゜Д゜)

あるたんぱく質の精製なんですけど、不溶性画分に行くことが分かっています。
なので、不溶性画分を0.5%Triton/TH洗浄溶液で3度洗浄した後、その沈殿を
ウレア8Mを加えて攪拌後、rt/1h靜置しておき、遠心して上澄みと沈殿をSDSした所
何故か、まだ沈殿の方にタンパク質が存在しております。(・∀・?

8Mウレアは室温に保温しておいたヤツを使っているのですが、これが問題なのでしょうか?
何かこうやったらinclusion bodyから取り出せるよ、という知恵があればご教授ください。
よろしくお願いします。

285 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/29(金) 23:22:12
>284
最初に不溶性画分を分離するときに、遠心をきつくやりすぎないようにする。
細胞壁や核酸のようなタンパクを巻き込んでしまうものは酵素で消化しておく。
8 Mウレアを加えたら、物理的によく懸濁する。
それでもだめだったら疎水性相互作用でアグってるのでもうだめ。

286 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/29(金) 23:29:05
早速のお返事d
>細胞壁や核酸のようなタンパクを巻き込んでしまうものは酵素で消化
この部分の酵素とはDNaseでしょうか?
たしかに不溶性画分にウレア加えて放置したあとの溶液はドロドロなんです。
もしかして、精製不能でしょうか・・・・

287 :????:2005/07/30(土) 08:52:38
>284 、286
粘度が高い理由は核酸の混入と思われます。
それから0.5% Triton-X100濃度は適正なのでしょうか?
こちらは2.5%(v/v)でNaCl 0.5Mを含む
20 mM Tris-HCl, pH 7.4(4℃のとき)でやっています。

それから284さんのタンパク質は2 M程度のUreaに耐性を示すようですね。
だったら、それを逆手に取ってUrea洗浄をお勧めします。
2 M Urea溶液で洗浄を数回します。そうすると核酸やら他のタンパク質がカットされ
目的タンパク質はいつも沈殿します。そうやってPureなインクルージョンボディを稼ぎ、
クロマトワークを減らすのも良いのでは?

あと、目的タンパク質にシステインの架橋がいくつもあるのならば10 mM DTT
ジチオトレイトールで還元させてやると良いでしょう。
ちなみに当方の蛋白もDTT無しでは6 M Gu-HClに不溶です。
当方はUrea洗浄→6 M Gu-HCl(塩酸グアニジン), 10 mM DTTで溶解させてます。

288 :名無しゲノムのクローンさん:2005/07/30(土) 17:42:47
>>287さん
激しくお返事d

0.5% Triton-X100濃度に関しては以前成功したのでこの濃度を使っていただけで、深い意味は
ありません。モット高い濃度でやってみます。
Urea洗浄というのは思いつきませんでした。確かにUrea耐性は結構強いようなので、これをまず
試してみようと思います。ありがとうございました

289 :287(退役水兵):2005/07/30(土) 21:42:38
>288
知ってるとは思いますが、CHCl3(クロロホルム)を使う技もあります。
プラスミド抽出につかう要領でクロロホルムを用いて中間層をゲットする方法です。
もとは電気泳動のサンプル濃縮だったのですが、Triton-XやUrea洗浄にも応用可能です。
書き込みが長くなる恐れがあるので、リクエストくだされば書き込みます。

混乱させてしまったらゴメンナサイ。

290 :288:2005/07/30(土) 22:30:02
>>289
クロホルを使ってのタンパク回収情報禿げしくキボンヌです!!
ただ疑問なのはフェノールを使わなくてもタンパクって変性するものなのでしょうか?
また核酸なんかと絡まっているたんぱく質をフェノールだけでゲットできるとか・・・?

精製して巻き戻しもしなければならないし時間もないという切迫した状況なので、
退役水平さん、どうぞよろしくお願いします。

291 :288:2005/07/30(土) 22:31:23
>核酸なんかと絡まっているたんぱく質をフェノールだけでゲット
                             ↑
                 フェノールでなくてクロホルですorz

292 :退役水兵:2005/08/01(月) 08:26:23
>288
いわゆるタンパク質の有機溶媒沈殿(お手軽だけど蛋白変性は否定出来ない)です。
モッコリとした白いタンパク質中間層の状態は蛋白表面の水分子が
奪われた状態と見なして良い、すなわち変性状態と解釈しております。

やりかたは簡単。Total Volの1/10-1/5相当のCHCl3をぶち込んで
お手てでシェイクし、遠心後に中間層を集めます。
で、もう一度D.W.を加えてシェイク&遠心。最後はアセトンで下層CHCl3を溶かす&
タンパク質を沈殿させるだけです。

当方のやり方を示します。まずは菌体を集めた後に
1. 20 mM Tris-HCl, pH7.4(4℃)で懸濁。で、total volumeを見積もる。
2. Total volumeの1/10量の5 M NaClを入れる(final 0.5 M)。
3. 最終濃度0.2 mg/mLとなるようにリゾチーム投下。On ice 60-90min放置
4. Total volumeの1/10量の25% Triton-X100投下(final approx 2.5%)。
5. On ice 30 min放置
6. 20,000 x gで遠心分離。ここで、どろどろの物質(核酸)が上清に*。
7. 沈殿物もなにやらどろどろしていると思う。
8. 気にせず2M Urea, 0.5M NaClを含むTrisでよくよく懸濁。
9. 20,000 x gで遠心分離。上清をとる*。沈殿を集める。
10. まぁだどろどろしてると思う。
11. 気にせず0.5M NaClを含むTrisでよくよく懸濁。(Total1.2 mL/1.5 mLチューブ)
12. Total Volの0.2 mLのCHCl3を加え、遠心。
13. 上清を捨てる。中間層&下層(CHCl3)にD.W.を1.5 mLの目盛までUP。
14. 遠心し、上清を捨てる。中間層&下層(CHCl3)にアセトンを1.0-1.2 mLの目盛までUP。
15. 良く撹拌。CHCl3がAcetoneに溶解するのが分かる筈。
16. 遠心して沈殿ゲット。

最後に:*で示した上清はSDS-PAGE&Westernのときのサンプルとして用います。
各行程の結果を占う為に役立つ筈。こいつらもCHCl3で蛋白抽出しておくのが良いでしょう。

長レスすまんね。

293 :288:2005/08/02(火) 01:48:14
>>292
詳細なプロトコールありがとうございます。
早速明日にでも試してみようと思います。
UreaやGlu-HCl以外にもこんなInclusion Bodyからの取り出し方が
あったとは知りませんでした。


まだまだ勉強不足を痛感・・・・○| ̄|_

294 :252:2005/08/02(火) 01:51:42
あほな質問ですが、精製したIgG(ウサギ)のSDS-PAGE(還元状態)での
分子量知っているかた教えてください。今50キロに単一バンドがきれいに見えているんですが
誰か同じようなことやった人いませんかー?

295 :?退役水兵???:2005/08/02(火) 07:36:36
>293
あ、わすれていた。Ureaが多いとCHCl3でUrea析出が見られます。
D.W.洗浄を忘れないで下さい。

CHCl3を用いる方法は市民権を得られていないので、
従来の方法より有効であることをお示しになることが不可欠です。

御指導を仰ぐ先生への説明はもとより、なにより貴方ご自身の知識と自信に
繋がることでしょう。

296 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/03(水) 00:51:28
質問です。

膜タンパクの精製をやっています。
カラム精製で外れてしまった複合体のコア部分と周辺サブユニットを再構成させたいんですけど、
やはりDetergentがあるせいか通常の方法(透析膜で脱塩しながら)では上手くいきません。

どなたか良い方法ご存知で無いでしょうか?

297 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/03(水) 03:11:20
ホイミの呪文って、いつつかえばいいんですか?

298 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/03(水) 08:52:04
巻き戻しにはベホマズンくらい協力じゃないとだめ

299 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/03(水) 16:09:17
>>297-298
っ【ザオラル】

300 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/03(水) 18:52:39
大腸菌を使ったタンパク質発現。
いくつかのvector, host, 温度,IPTG濃度を試しましたが、発現しません。
他に何か振るファクターはあるでしょうか。
もしくはよいvector,hostを教えていただけないでしょうか?

当然シーケンスは確認してあります。1500bp。500aa。

301 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/03(水) 20:21:40
>>300
in vitroのキットでもどうでしょう?

あと499A.A.ではないでしょうか

302 :退役水兵??????:2005/08/03(水) 20:50:07
>300
温度、時間、IPTG濃度、Host、ベクターの全てを振ってもだめなら
T7系の発現系ではなくコールド系ベクターはどう?
TAKARAで確かキャンペーンしていたから買い時かも。

こちらも300さんと同じような兆候を示すタンパク質があり、
TAKARAのコールド系に切り替えます。
このタンパク質、645アミノ酸残基でCysが21個で1つのドメインに集中し、
推定pIが9.8で糖鎖無しの、見るからに厄介そうな輩です。

303 :?????????:2005/08/03(水) 20:56:45
>>296
タンパク質濃度が薄いとサブユニット再構築は上手くいかないよ。酵素/基質のES比を例に想い出してみて。
あと、見落としがちなのがEDTAなどのキレート剤やNaCl濃度。
もしコア部とサブユニットをそれぞれ単離精製できるのならば、ビアコアで結合を確かめてみたら?


304 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/04(木) 02:33:59
簡単にビアコアとは言えど、金チップに結合させるのに結構苦労するような気がするがなぁ・・・

305 :288:2005/08/04(木) 02:38:16
質問なんですが。。。。

上の不溶性画分からのたんぱく質精製読んでて不思議に思ったんですけど、
SDSなどの強い界面活性剤使って変性させるとか、それでも無理ならさらに
熱をかけて完全に変性させるとかって方法はダメなんでしょうか?
そんでもって、上にあるようなたんぱく質濃縮法とかでSDSなんかを取り除いて
カラムで精製。。。みたいな。

どうせ、後にリフォールディングさせるならかなり強い変性剤でやってしまえば
簡単なような気がするんですが・・・
素人質問で申し訳ないですが教えて下さいm(__)m

306 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/04(木) 10:34:22
>>305
熱変性は耐熱性菌由来蛋白の精製なんかで使うことがあるらしい。
うちのラボで扱ってる蛋白も熱に強いものは加熱して精製できるものがある。

ただ目的の蛋白を熱変性させてその後refoldってのはどうだろう。
理論上は可能だろうけど、ゆで卵を生卵に戻すようなもんだからな…
強い変性剤については簡単に除去できるならいいけど、SDSなんかは透析程度じゃ抜けないだろうね。
でも目の付け所はいいんじゃない。

307 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/04(木) 12:18:34
>305
リフォールディングがそんなに万能なら苦労しない。
一時期新しいリフォールディング法を模索したがうまくいかなそうだった。
そもそも昔のRNaseなんかでAnfinsenのドグマが成り立つなんて言ってたが
複合体として他と相互作用する分子なんて、単独の状態の最安定構造と
実際に複合体を形成している構造が違うはず。
こうなると単純なリフォールディングは意味無し。

308 :体液水兵:2005/08/04(木) 18:13:30
>252, 294
還元状態で約25 kDa(軽鎖)+約55 kDa(重鎖)
非還元で150 kDa程度のはず?

>305,306
SDS除去は(CHCl3/MeOH/D.W.=1:4:3 v/v)によるPhase separation&
MeOH沈殿が有効。Rapid Commun. Mass Spectrom. 13, 344-349

>307
禿同。だから抗体作製のみに大腸菌系を用いることもある。ケースバイケースだよね。

309 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/05(金) 20:55:07
The Protein Purification Facility
ttp://www.ls.huji.ac.il/~purification/index.html

最近このサイト見つけたんだけど結構有名なのかな?
タンパク質の精製はもちろん発現から関連情報まで幅広くカバーしてるから
初心者はもちろんタンパク質の扱いに慣れてる人でも結構役立つように
思うんですが。
あと各社から出ているマニュアルがダウンロードできるんですが、それに
混じってアマシャムが売ってるタンパク質精製の各ハンドブックのPDF
もダウンロードできるんだけどいいのかなあ(もちろん英語版だけ)?
自分はハンドブック全部ダウンロードしちゃったけど。

310 :アフィニティーカラム:2005/08/06(土) 22:16:35
CNBr-sepharoseにリガンドを結合して、アフィニティーカラムを作ろうと
しているんですが、sepharoseにリガンドが結合しているのか確認する目的で、
sepharoseを一部とって、SDS-PAGE-BUfferを入れて、ボイルした後、
PAGE-Gelに流しても、リガンドがさっぱり見えないのですが、
これって、もしかしたら一端、リガンドが共有結合してしまえば、
いくらぐつぐつ、煮ても、溶出しないってことなのでしょうか?
リガンドがどれくらい結合しているかをモニターする方法って
あるんでしょうか?

311 :名無しゲノムのクローンさん :2005/08/06(土) 23:46:26
>>310

おひおひ、当たり前だろ。
通常は、吸着前のbuffer中のタンパク濃度、
吸着後のbuffer中のタンパク濃度を測定して推測するだろ。

312 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/07(日) 09:57:59
>>310
君は底なしの馬鹿だな。


313 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/07(日) 14:43:44
>310
釣り?

314 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/07(日) 18:06:51
分子量マーカーって高いよね。
自作している人っている?

315 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/08(月) 21:57:25
してますが、なにか?
市販品も持ってるけどね。

316 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/09(火) 05:44:11
>>315
手持ちの精製済みタンパクを混ぜるだけ?
汎用的な自作マーカーってある?

317 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/10(水) 02:58:35
ttp://66.102.7.104/search?q=cache:89_jcO4iOTIJ:www.ktokai-u.ac.jp/~nougaku/Bio/araki/page.htm+&hl=ja&start=1&lr=lang_ja
ここにあるのと同じ感じで作ってる
だいたい一回作ると2-3年は持つ。昔は市販品なんて買えなかった。

最近は市販品も安くなったけどねぇ

318 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/10(水) 04:14:58
>>317
ありがとう!

誰か他に自作マーカー作ってる人いたら、教えて

319 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/12(金) 14:00:31
質問なんですが、、、、
Gタンパクみたいな7回膜貫通型受容体の膜タンパクの融解法だれかしりませんか〜
western blotするのに色々な融解法を試したのですが
全然上手くいかなくて、いい方法知ってる人いたら教えてください

320 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/12(金) 15:15:48
>>319

バカ。三量体G蛋白質は7回膜貫通型受容体と結合して活性化されるんだ。
G蛋白質は表在性膜蛋白質、7回膜貫通型受容体は内在性膜蛋白質だ。
前者は弱い界面活性剤で水溶性になる。後者はTriton-X100とかデオキシコール酸とか
膜リン脂質を可溶化する条件できるような強めの界面活性剤でないと無理。

321 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/12(金) 15:20:06
>>318
指先ちょろっと切ってやったら色素入りのが出てくるけど?
いい具合にラダーになってくれる。

322 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/12(金) 16:16:10
Triton-X100とかデオキシコール酸とか膜リン脂質を可溶化する条件の
できるだけ詳しい量とか濃度とかわかりますか?

323 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/12(金) 16:44:05
RIPAバッファーと同じ組成でいいんぢゃねぇか?
>TritonX-100、デオキシコール酸の濃度。

RIPA: 1 % [w/w] Nonidet P-40, 0.5 % [w/v] sodium deoxycholate,
0.1 % SDS, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, ,,,

324 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/12(金) 16:58:41
ありがとうございます。それとなんどもすみません。
この組成で、融解法って超音波や凍結融解をすればいいのですか??どんな方法を使ってますか??


325 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/12(金) 17:15:49
ピペッチングで簡単に分散させたあと、氷中で冷やしながら小さなスタラーバーを回して
20-30分mixしたら?その後、10万xgで30分遠心して上清画分を使う。

326 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/12(金) 17:19:05
わかりました。1度その方法で試してみます。いろいろありがとうございます。

327 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/12(金) 17:42:10
WBなら普通にSDS入りバッファで溶かせよ。

328 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/19(金) 06:39:20
アフィニティ・カラムから8Mのureaを使って溶出して、
各フラクションをSDS-Pageで展開して、タンパクのバンドを、
proteomic analysisにかけようとしています。
アフィニティ・カラムから溶出したフラクションは、TCA沈殿などで
濃縮してPageにloadするものなのでしょうか?
そのままのっけるにはボリュームが多いのです。


329 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/19(金) 16:16:36
AGE

330 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/19(金) 20:16:47
>>828
濃度が十分あれば一部をそのままロード
そのままロードしてタンパク量が足りないのなら濃縮してロード

331 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/19(金) 20:17:46
うへぇ、とんでもないロングパス
>>330>>328

332 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/19(金) 23:00:38
>>828期待age

333 :328:2005/08/20(土) 06:57:16
>濃度が十分あれば一部をそのままロード
そのままロードしてタンパク量が足りないのなら濃縮してロード

いえ、そのままのっけるには、ボリュームが大きすぎるので、濃縮を考えているのですが、
で、8M ureaの溶出液を直接, TCA沈殿してもいいのでしょうか?
それとも透析して、Ureaを除去するべきか?
あるいは違う濃縮法を選ぶのか?
という質問なんです。

334 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/20(土) 08:48:20
とりあえず、8MのUreaを使って溶出という時点で理解不能。
NiカラムなのかGSTからむなのか何のアフィニティーか分からないとアドバイスできんぞぇ

んで、一度もSDSすらやっていないのに書き込まない方が良いだろう。
いくらこちらがアドバイスしても君が濃縮濃縮言っている時点で会話にならん。
ちなみに8Mureaで溶出したと言っているが、本当にそんな条件で溶出したとして
SDS流すと、塩濃度の濃さからまともにPAGEできんと思うがな。


ということで、勝手にやってみれば〜〜('A`)

335 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/20(土) 11:31:48
>>328 は、思うに…、
エサのタンパクでアフィニティーカラムを作って、
それに結合するものを回収してみた。
あわよくばMS/MSとかで面白いもの同定することを夢想中。
…なのかなぁ?

だとしたら濃縮せずに出来るだけたくさんloadでつね。
1枚のGelに全サンプルのっけようとしない。
濃縮でおいしいものどっか行くかも…。
Ureaは気にしない。
バンド薄かったら、スケールアップして再アフィニティー。

336 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/20(土) 12:57:56
>SDS流すと、塩濃度の濃さからまともにPAGEできんと思うがな。

ハア?W
あんまり度素人のいうことを当てにするなW
まず、8M Ureaの溶出液を透析して、その後、
アセトンか、何かで濃縮してPAGEに流してみればいい。

337 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/20(土) 13:09:08
>>328
SDS-PAGEのとき、Ureaサンプルであれば電気泳動展開のときに影響は特に及ぼしません。
実際に「Urea-SDS-PAGE」というものがあり、15 kDa以下のペプチドの分離に効力を発揮します。
通常のSDS-PAGEに比してシャープな分離能が魅力です。

それから、Ureaサンプルをそのまんまボイルするとタンパク質のカルバミド化が生じ、その結果PMF解析に
影響を及ぼす危険性があります。還元状態で展開するのであれば、R/T、10 mM DTTで
30分程マターリと還元することが肝要です。

濃縮はゴールデンスタンダードと思われる方法でトライするべきです。
やってみなければ何も分かりませんし、329-335の皆様もアドバイスの
しようがありません。

338 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/21(日) 01:09:40
328は何故うれあで溶出するのか?

339 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/23(火) 01:07:32
BL21とかJM109でHistagタンパク発現させてHistag抗体でウエスタンしたとき、
45k付近にバンドでません?発現タンパク質じゃない たぶん大腸菌由来の

340 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/23(火) 08:33:29
偶然見つけたんですけど、おもしろいスレですね。
そこで質問させていただきたいんですけど、自然食品で最もタンパク質摂取
できる食品はなんだと思いますか?

341 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/23(火) 09:20:21


342 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/23(火) 15:28:29
卵が良い。

343 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/23(火) 15:30:05
yeast extractが良い。

344 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/23(火) 15:47:36
食品成分データベースで、タンパク質含量が特に多い物を調べると、
肉類/ぶた/[その他]/ゼラチン(87.6%)
卵類/(鶏卵類)/卵白/乾燥卵白(86.5%)
乳類/(その他)/カゼイン(86.2%)
魚介類/(さめ類)/ふかひれ(83.9%)
豆類/だいず/[その他]/大豆たんぱく/分離大豆たんぱく (79.1%)
魚介類/(かつお類)/加工品/かつお節 (77.1%)
魚介類/(いわし類)/たたみいわし (75.1%)


345 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/23(火) 16:30:56
>>340

タンパク質重量の他に、必須アミノ酸含量とかアミノ酸量バランスも重要で
過剰なアミノ酸摂取は通風とか腎臓に負担がかかったり代謝異常が起こりそうだが。

346 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/23(火) 18:55:55
水分の重量比はばかにならないので
スキムミルク
乾燥卵白
干し肉


347 :340:2005/08/23(火) 19:57:19
筋トレしてるんですけどプロテイン買うのはもったいないんで、タンパク質は
納豆で摂取してるんですけど、どうですか?納豆にもけっこうタンパク質入ってる
と思うんですけど、どうですか?


348 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/23(火) 21:07:25
>347
ウエイトトレ板にいくといいよ。

349 :340:2005/08/23(火) 22:35:08
生物板のみなさんの見地からみてどうですか?

350 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/24(水) 12:49:43
>349
生物板の見地ではおよそないのだが、
プロテインを買ったほうが、タンパク質量あたりの単価が安い。
納豆はアミノ酸の偏りがあるし。

351 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/25(木) 02:55:59
なんか精製されたサプリメントばっかり摂ってると良くないような気もする
納豆いいじゃないか。ミネラルとかビタミンも摂れるし。

352 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/25(木) 10:28:41
納豆菌ってオートクレーブじゃ死なないらしいな

353 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/25(木) 18:50:19
ttp://www.uploda.org/file/uporg177463.jpg
(´・ω・) カワイソス

354 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/25(木) 19:00:52
>>353のデスクトップ画像に見覚えのある方、山田ウイルスに感染しています。
山田ウイルスに関する詳細と駆除方法は下記サイトを参照して下さい。
ttp://www3.atwiki.jp/yamada/

また下記スレに来ていただければ、駆除のお手伝いをします。
夏も終盤(´・ω・) カワイソス 山田ヲチスレ 160
http://tmp5.2ch.net/test/read.cgi/download/1124785717/

355 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/25(木) 19:24:30
ttp://www.uploda.org/file/uporg177463.jpg
       ↑
ワードの文書ファイル……  ~$folding.doc
デスクトップのショートカット………  Laboratory

(´・ω・) カワイソス

356 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/25(木) 19:58:00
ttp://www.uploda.org/file/uporg177489.jpg
ttp://www.uploda.org/file/uporg177498.jpg

ウイルスバスターやNortonではほとんど検出されない新種かも
(´・ω・) カワイソス

357 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/25(木) 20:03:02
だれか凸かけてやって下さい
下手すりゃ実験内容も分かってしまいますがな(´・ω・)カワイソス

358 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/25(木) 23:53:00
>>352
生菌はもちろん、胞子も死にますよ?

359 :エロエロウイルスに感染しています!:2005/08/26(金) 00:56:27
(´・ω・) カワイソス


360 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/30(火) 15:34:00
教えてください!
あるタンパクを発現できなくてこまっています。
ものはpETにつながっていてシーケンス済み。
発現したタンパクは15Kぐらいになるはず。BL21(DE3)pLysSコンピに形質転換。
Amp入り2×YT 37℃で培養。OD=0.4ぐらいでInduction。IPTGは0.4mMです。
Inductionかけてから3時間 37℃で回収しています。
何種類か同じやり方でやってたけど、なぜだか今やっているのだけ発現しない。
なにか気づいたことあれば教えて下さい



361 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/30(火) 15:37:00
どこまでトラッキングできてんの?
RNA発現みてる?
フレームは?配列確認した?

362 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/30(火) 16:34:30
全部確認済みです。
ボスは一概にここが悪いとか言えないといってたくらい。
なぜなのかわからんのですわ。
inductionしてSDS−PAGEしたら発現してるか普通はわかりますよね?
けど、わからなくでも発現してることってありますかね?
前に一度そういうのあったから・・・まぐれだと思うけど。


363 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/30(火) 18:05:33
染色法変えて見たら?
で、RNAの発現まで確認できてんのに染色されないってこと?
WBしてみれば〜

364 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/30(火) 21:32:12
封入体になっているのでは?
WBのときに確認してけろ

まれにちゃんとやっても発現しないことがある
トランスフォームからやり直すとよいかも

365 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/30(火) 21:34:53
>inductionしてSDS−PAGEしたら発現してるか普通はわかりますよね?

すべてわかるわけではありません。
キレイに見るならWBがベストでしょうね。

366 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/30(火) 22:44:12
て言うか、CBB染色で見えないくらい発現が低いことなんてよくあるだろが。

367 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/31(水) 11:27:10
360です。
文献などではInclusion bodyにいくとなっています。
だから超音波処理してPAGEしたんですけど、それでもそれらしきものなくて・・・
WBしてみます。

368 :名無しゲノムのクローンさん:2005/08/31(水) 12:33:04
オレの経験だと、
inclusion bodies に行く奴は発現量が高い奴が多くてウエスタンするまでもなくCBBで見える。
っちゅうか、
whole extract 流してウエスタンしなきゃ見えん奴の場合、不溶性画分に行っている奴ってinclusion bodies 形成しているんかな?

オレだったらpLys をまず止めてみる。pLysって発現をサプレスしてるでしょ。

RNA発現の確認なんてしないな。

ダメだったら最初に戻るというのも1つ。
元cDNAからpETへのサブクローニングを自分でやったのなら、インサートが入っているコロニーをもう1つ2つ保存してるでしょ。
そいつらのシーケンシングとタンパク質発現チェックをするかな。
もしくはサブクローニングまで戻るか。
もしここまで戻るなら、他のコンストラクトも同時に作ってみる。
例えばC末ヒスタグをやってたならば、N末ヒスタグも同時進行で作るとか。

手っ取り早いのは、コンストラクトをかえたり、ホストをかえたりすることだと思うよ。


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